Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung

122 WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | PoFII – unabhängige Forschung
01 Funktionelle Genomik und Nischen-Spezifi zität
PROJEKTLEITER | Prof. Dr. Kenneth N. Timmis | Arbeitsgruppe Umweltmikrobiologie | kti@helmholtz-hzi.de
PROJEKTMITARBEITER | Dr. Sagrario Arias Rivas | Dr. Mónica Bassas Galia | Simrita Cheema |
Dr. Thorben Dammeyer | Dr. Isabel Hartmann | Dr. Stefanie Libnow | Dr. Gabriella Molinari | Dr. Daniela Näther |
Kateryna Selezska | Dr. Johannes Sikorski | Dr. Joao Vieira de Castro | Montri Yasawong.
Die Flora des menschlichen Gastrointestinaltraktes (GI)
wurde als weiteres Organ des menschlichen Körpers und
als Hauptabschnitt des menschlichen “Bioms” defi niert.
Damit lässt sich die Vielzahl unterschiedlichster Funktionen
und Aufgaben zum Ausdruck bringen, die das Biom für den
Organismus erfüllt. Und es würdigt den Umfang, in dem
das Biom den menschlichen Phenotyp beeinfl usst. Trotz der
wichtigen Aufgaben bei der Wahrung des Gleichgewichts
zwischen Gesundheit und Krankheit, ist und bleibt dieser
Bereich vielgestaltig, veränderlich, schwer zu untersuchen
und ist noch wenig erforscht. Aktuelle großangelegte
Metagenom-Projekte dienen dazu, die Kenntnisse über die
Zusammensetzung und die funktionale Genomik dieser
mikrobiellen Ökosysteme zu erweitern. Dabei konzentrieren
sich jedoch die Untersuchungen auf die zahlreichen Elemente,
die am besten zugänglich sind und vermutlich die
wichtigsten Funktionen haben.
Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), zu
denen Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und andere Formen
der Kolitis zählen, sind komplexe, multifaktorielle Entzündungszustände.
Von ihnen ist bekannt, dass sie durch
verschiedene Genloci bestimmt werden, von denen man annimmt,
dass sie durch die mikrobielle Darmfl ora ausgelöst
bzw. manifest werden. Im Rahmen einer Kooperation mit
der Universitätsklinik Kiel (Schreiber, Ott) und der Universität
der Balearen (Nogales, Lanfranconi) haben wir für die
Suche nach mikrobiellen Korrelationen mit Darmerkrankungen
Schleimhautbiopsieproben aus den entzündeten
Bereichen des Sigmoids von Patienten erhalten, die an verschiedenen
Formen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen
leiden. Daraus haben wir 16S-Ribosomal-RNA-Genklonbibliotheken
erstellt, die Klone sequenziert und deren
phylogenetische Zuordnungsparameter bestimmt. Obwohl
die mikrobielle Besiedelung des Dickdarms größtenteils aus
Bakterien besteht, gehören dort die methanogenen Archaebakterien
zu den kleineren Populationen. Daher haben wir
zusätzlich zu den Bibliotheken der bakteriellen 16S-rRNA-
Gensequenzen auch Bibliotheken der 16S rRNA-Gene der
Archaebakterien erstellt, die durch niedrig stringente
Amplifi kation unter Verwendung von Primern der Archaedomäne
gewonnen wurden. Überraschenderweise ergaben
eine Reihe von Biopsien Sequenzen von Elementen der
Halobacteriaceae, zusätzlich zu den erwarteten Sequenzen
von Methanogenen. Dieses Ergebnis war einerseits unerwartet,
weil der Gastrointestinaltrakt nicht als salziges
Milieu gilt und es zuvor noch keine Hinweise auf eine
Besiedelung dieses Traktes durch halophile Archaebakterien
gab – und andererseits wegen der außerordentlich
großen Vielfalt und der großen Anzahl neuartiger geklonter
Sequenzen: 269 Halobacteriaceae-spezifi sche Sequenzen
aus den Biopsien, die in 15 verschiedene Phylotypen untergliedert
wurden (die nahezu die gesamte phylogenetische
Breite dieser Familie abdeckten), wobei 9 davon neu waren.
Für die Koloskopien waren zunächst Darmspülungen mit einer
Lösung aus Polyethylenglykol und Salzen erforderlich, so
dass die haloarchealen Sequenzen möglicherweise von der
Spüllösung stammen. Wir erhielten vom Krankenhaus zwei
ungeöffnete Spüllösungspackungen, in denen die Biopsien
aufbewahrt wurden und, zum Vergleich, eine Packung von
demselben Hersteller über eine Apotheke in Palma, Mallorca,
und eine andere von einem anderen Hersteller aus derselben
Apotheke. Die DNA-Isolierung, die Amplifi kation und die
Sequenzierung der archivierten Klone wurden wiederholt.
Desweiteren wurden 8 Stuhlproben von Patienten mit
chronisch entzündlichen Darmerkrankungen untersucht, bei
denen die Darmspülung nicht durchgeführt worden war. Die
Halobacteriaceae-ähnlichen Sequenzen fanden wir in 2 der 8
Stuhlproben (76 Sequenzen) sowie in allen Spüllösungsproben
(125 Sequenzen), wobei letztere in 17 Phylotypen eingeteilt
wurden und keiner davon mit den Phylotypen übereinstimmte,
die in den Patientenproben gefunden wurden.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass die halophilen
Bakterien im menschlichen Darm von dem mit der Nahrung
aufgenommenen Tafelsalz stammen könnten. Das zuvor erläuterte
Verfahren wurde mit 3 Tafelsalzproben wiederholt,
und wir erhielten 34 Sequenzen von Haloarchaebakterien,
die 11 Phylotypen repräsentierten. Keiner dieser Phylotypen
stimmte mit denen aus den Spüllösungen überein, wobei
nur einer der Phylotypen auch bei den Patienten vorkam.
Die verwendete experimentelle Methode ermöglicht keine
Unterscheidung zwischen toten Zellen/freier DNA und
überlebensfähigen, metabolisch aktiven Zellen. Deshalb
wurden Anreichungskulturen für halophile Bakterien
angesetzt, die aus der Biopsie eines Patienten stammten.
Als Ergebnis erhielten wir Sequenztypen von Haloarchaebakterien,
führten dann eine Hybridisierungsanalyse mit
Hilfe der in situ Fluoreszenzmethode durch und erhielten
nacheinander überlebensfähige Archaebakterienzellen in
diesen Kulturen. Fazit: Während die Haloarchaea über die
Nahrung ständig in den Gastrointestinaltrakt gelangen,
konnte aufgrund des fehlenden Zusammenhangs zwischen
Tafelsalz und Magendarmtraktphylotypen nicht ermittelt
werden, ob diese Phylotypen vom Tafelsalz oder von den
Spüllösungen stammen.