Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung

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26 BERICHTE AUS DER FORSCHUNG | Grenzgänger der Hepatitis C Virus-Forschung Dosen von Prednisolon und anderen Steroiden während der Infektion zu einer vermehrten Infektiosität von HCV führte. Durch Zeitkinetikexperimente konnten wir nachweisen, dass HCV unter Steroidbehandlung schneller in die Leber zelle eindringen kann. Mithilfe retroviraler Pseudotypen konnte außerdem nachgewiesen werden, dass die Steigerung der Infektiosität spezifi sch für HCV, jedoch unabhängig vom Genotyp war. Zur weiteren Charakterisierung wurde dann der Einfl uss von Prednisolon auf die für HCV bekannten Rezeptoren untersucht. Hier zeigte sich eine Steigerung der mRNA und der Proteinexpression von SR-BI und Occludin, zwei Proteinen, die essenzielle Kompo nenten des HCV-Rezeptorkomplexes sind. Dieser Steroideffekt konnte durch den Glucocorticoidrezeptor-Inhibitor RU-486 aufgehoben werden. Dies belegt, dass diese Signalkaskade für den Einfl uss auf die Rezeptorexpression und den HCV-Zelleintritt verantwortlich ist. Schließlich konnten wir in weiteren Untersuchungen zeigen, dass die Förderung der HCV-Infektion nicht nur auf die Hepatoma-Zelllinie Huh7.5 begrenzt ist: so führte die Inkubation von Prednisolon auch zu einer gesteigerten Infektion von DMSO-differenzierten Leberzellen und primären humanen Hepatozyten. Dieses Ergebnis korreliert somit mit der klinischen Erfahrung im Patienten: denn in verschiedenen klinischen Studien wurde nachgewiesen, dass die Gabe von hohen Dosen von Steroiden, beispielsweise im Rahmen einer Abstoßungsbehandlung, mit einem Anstieg der HCV-Viruslast und einer Zunahme der Hepatitis assoziiert ist 8 . Dementsprechend könnte die Vermeidung von hoch dosierten Steroiden dazu beitragen, den klinischen Verlauf nach der HCV-induzierten Lebertransplantation zu verbessern. Hepatitis C – nicht nur in der Leber? Bislang hat sich die Forschung an HCV vorwiegend auf die Leber konzentriert – eine naheliegende Fokussierung, da sich die Symptome vorwiegend auf die Schädigung dieses Organs zurückführen lassen. Bei genauerer Betrachtung löst eine Infektion mit HCV jedoch auch noch eine Reihe andere Symptome aus, die nicht unbedingt in einem direkten Zusammenhang mit der Leberentzündung stehen. Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion zeigen vielfach zusätzlich unterschiedliche Störungen des Nervensystems. Häufi g treten das Chronische Müdigkeits-Syndrom, Depressionen und kognitive Störungen auf. Allerdings ist unklar, ob diese Symptome auf eine direkte HCV-Replikation im Gehirn und den peripheren neuronalen Zellen zurück zu führen ist, oder auf indirekte Effekte am zentralen und peripheren Nervensystem. Deswegen haben wir untersucht, ob Wirtszellen aus diesen Geweben – darunter menschliche Neuroblastoma- und Glioblastoma-Zelllinien und Mikroglia Zellen – HCV-Partikel aufnehmen und das Virus vermehren können 4 . In diesem Zusammenhang sind wir auf die humane periphere Neuroblastoma-Zelllinie SKNMC gestoßen, die sämtliche HCV-Eintrittsfaktoren präsentiert und effi zient von unseren HCV Pseudopartikeln (HCVpp) infi ziert wurde. Allerdings haben unsere Untersuchungen ebenfalls gezeigt, dass sich das Virus in diesen Zellen nicht vermehren kann. Dennoch deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass HCV durchaus in verschiedene nichthepatische Zelltypen eindringen und mit diesen Reservoirs den Krankheitsverlauf beeinfl ussen kann. Kleine Moleküle gegen ein ungelöstes Problem Die Therapieoptionen gegen HCV sind derzeit noch unbefriedigend. Zwar befi nden sich eine Reihe direkter antiviraler Substanzen in der klinischen Entwicklung, aber unerwünschte Arzneimittelwirkungen, Resistenzbildung und genotypspezifi sche antivirale Aktivität führen nach wie vor zu Einschränkungen. Aus diesem Grund wird weiter nach neuen Therapiewegen gesucht. Im Fokus stehen Kombinationen gut verträglicher Wirkstoffe, die an unterschiedlichen Stellen des HCV-Replikationszyklus ansetzen. So soll eine rasche Resistenzbildung vermieden werden. Um niedermolekulare Substanzen zu identifi zieren, die unterschiedliche Schritte des HCV-Replikationszyklus stören, haben wir einen neuen Dual-Reportergen-Assay entwickelt und gemeinsam mit Wissenschaftlern am HZI für Hochdurchsatz-Screening-Verfahren angepasst (Abbildung 4). Es bildet den gesamten HCV-Lebenszyklus ab und ermöglicht deswegen prinzipiell die Identifi zierung von Hemmstoffen gegen jeden einzelnen Schritt der viralen Vermehrung 10 . Das System basiert auf einem HCV-Reportervirus, das das Gen für ein Luziferase-Enzym des Leuchtkäfers trägt (F-Luc; fi refl y luciferase). Die Wirtszellen, die für die Vermehrung von HCV verwendet werden, haben wir ebenfalls mit einem Luziferase-Gen – das des Tiefseekrebses Gaussia (G-Luc; gaussia luciferase) – ausgestattet. Da die beiden Luziferasen unterschiedliche Substrate nutzen und sich nicht gegenseitig beeinfl ussen, werden in einem Arbeitsgang gleichzeitig die Vermehrung des HCV und die Vitalität der Zellen bestimmt. Auf diese Weise können wir antiviral wirkende Verbindungen von Hemmstoffen des Zellwachstums und zytotoxischen Molekülen unterscheiden – also die Spreu vom Weizen trennen. Zunächst haben wir das System anhand bekannter HCV-Inhibitoren für den Zelleintritt, die Replikation und den Austritt validiert.
Anschließend haben wir aus der Substanzbibliothek des HZI niedermolekulare Verbindungen aus Myxobakterien getestet. Aus diesem Screening sind eine Reihe von Ver - bindungen hervorgegangen, die entweder den Zelleintritt des Virus in die Leberzellen verhindern oder deren Vermehrung beziehungsweise Wiederaustritt aus der Zelle. Aus diesen Molekülen hoffen wir, gemeinsam mit unseren Partnern am HZI und den Myxobakteriologen um Rolf Müller am HIPS, Leitstrukturen für neue HCV-Inhibitoren entwickeln zu können. Parallel wollen wir diese Substanzen nutzen, um besser zu verstehen, wie sich HCV in Leberzellen vermehrt (Abbildung 5). In dieser Hinsicht bieten uns die myxobakteriellen Naturstoffe einen einmaligen Zugang, zellbiologische Prozesse zu manipulieren und zu beobachten, wie HCV davon beeinfl usst wird. Für diese Zwecke sind durchaus auch die Verbindungen interessant, welche die Vermehrung von HCV steigern. Verstehen wir erst, welche Prozesse in der Zelle dafür verantwortlich sind, können wir in Zukunft Wege fi nden, dieses Zusammenspiel des Virus mit der Zelle für therapeutische Zwecke zu nutzen. A B Firefl y ”F-Luc” Deep sea crab Liver cell with Reportergene ”G-Luc” Abb. 4. HZI Pipettierroboter im S3* Sicherheitslabor zur Durchführung von Hochdurchsatz-Screenings. Grafi k & Foto: Twincore BERICHTE AUS DER FORSCHUNG | Grenzgänger der Hepatitis C Virus-Forschung HCV Reportervirus Virus production +/- Substance Measurement of reporter activity Abb. 5. Einfl uss kleiner Moleküle mit antiviraler Wirkung gegen HCV auf die Bildung von lipid droplets in Leberzellen. HCV-infi zierte Zellen wurden mit Solvens oder einem Inhibitor inkubiert. Lipid droplets wurden mit einem anti-ADRP Antikörper (links) oder einem Lipidfarbstoff grün gefärbt (kleines Bild). HCV-Core wurde mit einem core-spezifi schen Antikörper nachgewiesen (rechts und rote Markierung im kleinen Bild). Inkubation mit dem Inhibitor führt zur Vergrößerung und Aggregation von lipid droplets sowie zur Anreicherung von HCV Core an deren Oberfl äche. Grafi k: Twincore 27
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