Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung

WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 77
01.9 Mykobakterielle Phagosomen und Immunität
PROJEKTLEITER | Dr. Maximiliano G. Gutierrez | Nachwuchsgruppe Phagosomen Biologie | mgg08@helmholtz-hzi.de
PROJEKTMITARBEITER | Achim Gronow | Bahram Kasmapour | Gang Pei | Dr. Cristina Vazquez
M. tuberculosis ist so erfolgreich, weil es in der Lage ist,
innerhalb der Phagosomen von Makrophagen zu überleben.
M. tuberculosis blockiert die Phagosomreifung, insbesondere
die Phase, in der Phagosom und Lysosom fusionieren.
Dadurch kann es in den Makrophagen wachsen und trägt
zur Ausbildung des pathologischen Zustands bei. Die Mechanismen
hinter der blockierten Phagosomreifung durch
M. tuberculosis sind noch unklar. Vermutlich wird die Art der
Manipulation der intrazellulären Abwehrreaktion durch das
Mykobakterium von mehreren Faktoren gesteuert und erfolgt
dynamisch. Es wurden verschiedene intrazelluläre Angriffspunkte,
wie etwa die Rab-Proteine, in Betracht gezogen.
Sie könnten die Blockierung der bakteriziden Funktion einer
infi zierten Makrophage erklären. Das zeigt, dass der Eingriff
in den intrazellulären Stoffaustausch ein wesentlicher
Bestandteil der Überlebensstrategie dieses Pathogens ist.
Für die Vernichtung von intrazellulären Mykobakterien
durch die Makrophagen ist die NF-kB-Aktivierung erforderlich
(Gutierrez et al., 2008). Wichtiger ist jedoch, dass
die Blockade der NF-kB-Aktivierung die Fusion zwischen
mykobakteriellen Phagosomen und Lysosomen verlangsamt.
Über Mikroarray-Analyse des gesamten Genoms konnten wir
einige interessante Kandidaten ermitteln.
Die aussichtsreichsten Kandidaten sind dabei Rab34, Rab20
und Sortilin. Obwohl die Funktion dieser Proteine bei der
Phagosomreifung noch nicht bekannt ist, war die erste Aufgabe,
die Proteinfunktion in Verbindung mit der Phagosomreifung
zu charakterisieren. Auf dieser Basis können wir dann das
intrazelluläre Verhalten dieser Proteine während einer mykobakteriellen
Infektion von Makrophagen besser verstehen.
Abb. 1. RAW 264.7-Macrophagen, die Rab20-GFP (grün) exprimieren
und eine starke Infi zierung mit Mykobakterien (rot)
aufweisen. Einige der Bakterien befi nden sich in großen Rab20-
GFP positiven Vakuolen. Foto: HZI, Gang Pei
Rab-GTPasen und Phagosomreifung Für das Protein
Rab34 haben wir die polyklonalen Antikörper bestimmt
und gezeigt, dass sich Rab34 größtenteils im Golgi-Apparat
lokalisieren lässt. Lebendzellbeobachtung, Western-Blot-
Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen
haben gezeigt, dass das Protein Rab34 mit den Phagosomen
in Verbindung steht. Da dieses Rab-Protein wahrscheinlich
an der Fusion zwischen Phagosomen und Lysosomen beteiligt
ist, haben wir den Einfl uss der Rab34-Mutanten auf die
Akquisition von lysosomalen Markern durch Phagosomen
untersucht. Unsere Daten zeigen, dass die Expression von
konstitutiv aktiven Mutanten die Fusion zwischen Phagosomen
und Lysosomen verstärkt.
Für den Test mit Rab20 haben wir Rab20 in pEGFP-C1
geklont und einen negativen Mutanten generiert, der nicht
an GTP binden kann. Das Protein Rab20 steht mit dem Golgi-
Apparat und großen Vesikelstrukturen in Verbindung, und
vermutlich hat dieses Protein eine bestimmte Aufgabe bei
der Makropinosom-Bildung. Zudem besteht ein Zusammenhang
zwischen dem untersuchten Protein und den Latexkugelphagosomen
in der Frühphase der Internalisierung.
Bei der mykobakteriellen Infektion wurde das Protein
Rab20-GFP in die mykobakteriellen Phagosomen eingebaut
(Abb. 1), und wir untersuchen derzeit, ob dieses einen Einfl
uss auf die Phagosomreifung hat.
Zuordnung lysosomaler Enzyme zu Phagosomen Sortilin
vermittelt den direkten Stofftransport lysosomaler Enzyme
vom Golgi-Apparat zu den Latexkugelphagosomen – ein
weiterer Transportweg für Proteine, um während der Phagosomreifung
an den Lysosomen vorbei zu den Phagosomen
transportiert zu werden (Wähe et al., 2010). Wir planen,
den mykobakteriellen Stofftransport und die Vernichtung
der Mykobakterien mit einem Sortilin-KO-Mausmodell zu
untersuchen (in Zusammenarbeit mit Dr. A. Nykjaer, Aarhus,
Dänemark). Desweiteren untersuchen wir, welche Aufgabe
das Sortilin bei der mykobakteriellen Phagosomreifung hat.
Wir werden verschiedene Mutanten des Sortilin einsetzen,
die keine Signale an Adapterproteine, Endozytose oder
Retromer-Interaktionen weitergeben.
Fabrino, D. L., Bleck, C. K., Anes, E., Hasilik, A., Melo, R. C., Niederweis, M., Griffi ths, G.,
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Wähe, A., Kasmapour, B. , Schmaderer, C., Liebl, D., Sandhoff, K., Nykjaer, A., Griffi ths,
G., & Gutierrez, M. G. (2010) Sortilin mediates the transport of Acid Sphingomyelinase
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