Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung

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WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Wirt-Pathogen-Interaktionen
02.5 Die strukturelle Basis von Übertragungsbarrieren
für Säugetierprionen
PROJEKTLEITER | Dr. Thorsten Lührs | Nachwuchsgruppe Strukturbasierte Infektionsbiologie |
tlu07@helmholtz-hzi.de
PROJEKTMITARBEITER | Dr. Felix Deluweit | Dr. Vandana Gupta
Das Protein des Säugetierprions, PrP C , kann seine Konformation
von einem monomeren, löslichen in einen aggregierten,
übertragbaren Prionenzustand, PrP Sc , ändern. Sobald ein
Prion in einen suszeptiblen Wirt eingedrungen ist, löst es
eine zu einer Prionenerkrankung führende PrP-Konversionskaskade
aus (Abb. 1A). Es wurde beobachtet, dass Interspezies-Übertragungsbarrieren
mit der Aminosäuresequenz des
PrP korrelieren. Andererseits wurden multiple Prionenstämme
derselben PrP-Aminosäuresequenz identifi ziert, die bei
der Wirtsspezies charakteristische Erkrankungen hervorrufen.
Wir untersuchen die 3D-Strukturen der Prionen, um die
Übertragungsbarriere zwischen Mäusen und Hamstern auf
atomarer Ebene und die strukturelle Basis der Prionenstämme
in Bezug auf den Prionenwirtsbereich zu verstehen. Dazu
haben wir eine neuartige Methode entwickelt, um spezifi
sche aggregierte Prion-Konformationen in vitro herzustellen.
Wir verwenden eine Kombination aus solution-NMR, solid-
Abb. 1. Fortschritt bei der Prion in vitro-Amplifi kation. (A)
Das gutartige zelluläre Prionprotein, PrP C , ist ein häufi g
vorkommendes Säugetierprotein, das allerdings auch einer
Konformationsänderung und -aggregation zu einem infektiösen
Prion unterliegen kann, PrP Sc . (B) Wir haben eine neue
Methode entwickelt, die spezifi sche Scherkräfte (links) für
eine effi ziente in vitro-Amplifi kation von Prionen benutzt.
Ein Gerät, der Shear Induced Fragmentation /Aggregation
(ShIF/A) Array, ist von unserer Arbeitsgruppe zur effi zienten
Optimierung von vielen parallelen Konvertierungsreaktionen
entwickelt worden. (C) Mittels ShIF/A können wir rekombinante
PrP C in Proteinase K-resistente PrP Sc -Aggregate konvertieren,
wenn wir natürliche Hamster Sc237-Prionen als Kerne
benutzen (oben). In Reaktionen ohne entsprechende Kerne
wird keine Proteinase K Resistenz beobachten (unten). Für
eine optimale Prion-Amplifi kation muss die Rotationsfrequenz
des Rotors innerhalb enger Grenzen kontrolliert werden.
state-NMR und anderen biophysikalischen und chemischen
Verfahren, um strukturelle Aussagen über Prionaggregate zu
erhalten.
Übertragungsbarrieren Zwischen den verschiedenen
Säugetierspezies besteht in der Regel eine Speziesbarriere:
Mäuse entwickeln keine Prionenkrankheit, wenn sie Hamsterprionen
ausgesetzt sind. Transgene Mäuse, die zusätzlich
Hamster-PrP exprimieren, können mit Hamsterprionen
infi ziert werden und bauen dann das Hamster-PrP selektiv in
die Prionenpartikel ein. Die ausschließliche Expression von
chimärem Maus-/Hamster-PrP, mit der Bezeichnung MH2M,
macht Mäuse sowohl Hamsterprionen als auch Mausprionen
gegenüber suszeptibel. Die dabei entstehenden Prionen übertragen
die Krankheit sowohl auf Wildtyp-Hamster als auch
auf Wildtyp-Mäuse. Somit ist die Speziesbarriere teilweise
durch die primäre Aminosäuresequenz des Prionproteins
bestimmt, wobei die Substitution von nur wenigen Aminosäureresten
die Prionenübertragungsmuster vollständig verändern
kann. Dieses Konzept hat eine große Bedeutung, da
ein kausaler Zusammenhang zwischen der beim Menschen
vorkommenden Variante der Creutzfeld-Jacob-Krankheit und
dem Kontakt mit BSE-Prionen von Rindern besteht.
Probenaufbereitung von Prionen und Strukturanalyse
Ein wichtiges Verfahren ist die Konversion von mit Isotopen
markiertem ( 2 H, 13 C und 15 N) rekombinantem PrP in PrP Sc .
Für eine homogene Partikelvorbehandlung haben wir 2010
ein neuartiges Verfahren entwickelt (Abb. 1B/C), und zur
weiteren Reinigung und Charakterisierung verwenden wir
die asymmetrische Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4).
Mit diesem chromatographieähnlichen Verfahren kann man
Partikel nach ihrer Größe trennen, ohne dass eine stationäre
Matrix benötigt wird. Gleichzeitig werden die absoluten
hydrodynamischen Eigenschaften der einzelnen Partikelfraktionen
durch eine vielwinklige und dynamische Lichtstreuung
bestimmt. Dieses Verfahren kommt auch zur Charakterisierung
des Oligomerisationszustandes anderer Proteine
routinemäßig zum Einsatz.
Basisverfahren zur Proteinstrukturbestimmung sind die
NMR-Spektroskopie von Lösungen und Feststoffen, aber
auch andere biophysikalische Verfahren wie Fluoreszenz-,
FTIR- und CD-Spektroskopie. Der Vorteil ist, dass diese Methode
gegenüber geringen strukturellen Unregelmäßigkeiten
der untersuchten Proteinansammlungen unempfi ndlich ist.
So ist es möglich, zu einer “Konsensusstruktur” zu gelangen,
die wichtige strukturelle Einblicke liefert.