Ergebnisbericht 2010/11 - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung
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02 Rekombinante Proteinexpression<br />
WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Technologie-Plattformen 127<br />
LEITER | Dr. Joop van den Heuvel | Arbeitsgruppe Rekombinante Proteinexpression | jvh@helmholtz-hzi.de<br />
WISSENSCHAFTLICHE MITARBEITER | Dr. Konrad Büssow | Dr. Volker Jäger | Prof. Dr. Ursula Rinas<br />
Die als Arbeitsgruppe organisierte Plattform rekombinante<br />
Proteinexpression (RPEX) ist essentiell <strong>für</strong> die Produktion<br />
ultrareiner Proteine <strong>für</strong> die hochaufl ösende Strukturanalyse.<br />
In der AG RPEX sind die vier wichtigsten Expressionssysteme<br />
etabliert: E. coli, P. pastoris, das Baculovirus-Expressionssystem<br />
in Kombination mit Insektenzellen sowie<br />
verschiedene Säugerzellkulturen.<br />
Die „Facility“ Die Proteinproduktion umfasst eine neue<br />
Zellkulturanlage <strong>für</strong> die Herstellung von Proteinen aus<br />
Insekten- und Säugerzellkulturen und eine mikrobiologische<br />
Proteinexpressionsanlage. Die Anlagen mit mehreren<br />
Kultivierungsstationen können variabel mit Zellkulturreaktoren<br />
von 1,6 bis 6 Liter Arbeitsvolumen bzw. 2 bis 5<br />
Liter Bioreaktoren <strong>für</strong> Pichia pastoris und E. coli betrieben<br />
werden. Zur Reinigung endogener, niedrig exprimierter,<br />
(rekombinanter) Multiproteinkomplexe wurde zusätzlich<br />
ein 30-Liter-Bioreaktor in Betrieb genommen. Er ermöglicht<br />
die Herstellung von Proteinen im Pilotmaßstab.<br />
Die Downstream-Pilotanlagen erlauben die Konzentrierung,<br />
Diafi ltration und Reinigung von Proteinen aus großen Volumina<br />
bei Flussraten von 25-400 ml/min. Die Anlage wird<br />
eingesetzt um 5-100 mg verschiedener sekretierter Proteine,<br />
wie den humanen Wachstumsfaktor HGF, Varianten des<br />
cMET Rezeptors, den TLR2 Rezeptor sowie lysosomale<br />
Rezeptorproteine (LAMP) zu reinigen. Außerdem wurden<br />
größere Mengen natürlich vorkommender humaner Proteinkomplexe<br />
der humanen Zelllinie HeLa hergestellt.<br />
Technologietransfer und Support In Zusammenarbeit mit<br />
dem Max-Delbrück-Centrum <strong>für</strong> Molekulare Medizin (MDC)<br />
entstand ein Verbund zur Produktion und Reinigung von<br />
Proteinproben (PSPF, Protein Sample Production Facility).<br />
Dieses Gemeinschaftprojekt der HGF unterstützt die Strukturbiologen<br />
in Deutschland, indem es den wesentlichen<br />
Engpass, die Proteinherstellung, <strong>für</strong> die hochaufl ösende<br />
Strukturanalyse mit Röntgenkristallographie oder NMR-<br />
Spektroskopie beseitigt.<br />
Supportanfragen können direkt auf der Homepage<br />
www.pspf.de gestellt werden. Die Kapazität der Anlage wird<br />
zurzeit zu 50% <strong>für</strong> HZI-interne Projekte genutzt. Darüber<br />
hinaus bietet die Plattform Schulungsmöglichkeiten zum<br />
Thema Proteinexpression in Insekten- und Säugerzellsystemen<br />
<strong>für</strong> externe Wissenschaftler an.<br />
Infrastrukturen <strong>für</strong> die Strukturbiologie in Europa –<br />
Instruct <strong>2010</strong> wurde die HZI-PSPF in einer europaweiten<br />
Ausschreibung von der EU-Initiative „Instruct“ als <strong>Zentrum</strong><br />
<strong>für</strong> die Produktion von Säugerproteinen ausgewählt.<br />
PSPF-Trainingskurs zur Proteinexpression in Insektenzellkulturen<br />
Foto: HZI, Bierstedt<br />
In Kooperation mit Partnern aus Europa wird technischer<br />
und wissenschaftlicher Support in großen und einzigartigen<br />
technologischen Anlagen <strong>für</strong> die Unterstützung<br />
der struktur biologischen Forschung angeboten. Dadurch<br />
wird es möglich, neue Methoden zur strukturbiologischen<br />
Untersuchung von humanen Proteinen wie glykolysierten<br />
Rezeptorproteinen, Membranproteinen und Multi-Proteinkomplexen<br />
schneller zu entwickeln und zu nutzen.<br />
Forschung Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf<br />
der Neuentwicklung und Implementierung von schnellen<br />
eukaryontischen Produktionssystemen, die speziell <strong>für</strong> die<br />
Anforderungen strukturbiologischer Fragestellungen geeignet<br />
sind. Mehrere Kooperationsprojekte zur Analyse von<br />
einzelnen Proteinen und der Multiproteinkomplexe cMET,<br />
tcHGF , TLR1, TLR2, TLR5, ABCB6, LAMP2, LAMP3, GILT<br />
und -Tubulin Small Complex, werden in unserer Gruppe<br />
bearbeitet.<br />
Als Werkzeug <strong>für</strong> die schnelle transiente Expression von<br />
rekombinanten Proteinen wurde die transiente Transfektion<br />
in HEK293 EBNA1 Zellen einlizensiert, etabliert und weiter<br />
optimiert. Dieser transiente Produktionsprozess zeichnet<br />
sich dadurch aus, dass zwischen der Transfektion der Zellen<br />
und der Produktion der rekombinanten Proteine kein<br />
Medienwechsel notwendig ist. Durch spezielle Zufütte rungsstrategien<br />
während der Produktionsphase war es möglich,<br />
sc-Antikörper-Fusionsproteine mit Ausbeuten von mehr als<br />
350 mg L -1 herzustellen.
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