COLETÂNEA BITEC2008-2010 - CNI

188 COLETÂNEA BITEC 2008-2010extração de ácidos nucleicos utilizado foi uma versão modificada do protocolo estabelecido por Boome colaboradores (1990).Para produção de DNA complementares (cDNAs) foram utilizados 10 μL do RNA extraído, 5 μL(10pmol/μL) do iniciador antisenso de Lanciotti et al. (1992) e 5 μL do mix formado pelos reagentes dokit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). A solução foi incubada por 10 minutosà 25º C, posteriormente a 37º C por 120 minutos e a 85º C por 5 segundos, sendo então resfriada embanho de gelo. O cDNA obtido foi mantido à -20º C. Na amplificação do gene C-prM de DENV, foi usadoo kit AmpliTaqGold DNA Polymerase (Applied Biosystems), 10 pmol de cada oligonucleotídeo D2 e D1(LANCIOTTI et al., 1992). As amplificações foram feitas em termociclador da Applied Biosystems, modeloVeriti 96 wells Thermal Cycler, seguindo as seguintes variações de temperatura: uma desnaturação inicial95° C, por 12 minutos; seguida de 30 ciclos de desnaturação 94º C, por 50 segundos; pareamento 55º Cpor 50 segundos e extensão a 72º C por 50 segundos.Em seguida, foi feita uma reação de Semi-Nested PCR, utilizando os iniciadores mais internos desenvolvidospor Lanciotti e colaboradores (1992), que funcionam para identificar os quatro subtipos deDENV. O produto de PCR foi fracionado em gel de poliacrilamida 6% (acrilamida/bis (29:1), Tris/Borato/EDTA (TBE), 10% de persulfato de amônio (PSA), TEMED e H 2O). Os fragmentos considerados como positivosapresentam uma banda forte na altura específica para cada tipo de dengue, que são: DENV-1 – 482pb, DENV-2 – 119 pb, DENV-3 – 290 pb e DENV-4 – 392 pb.Para controle positivo das reações, foram usados mosquitos macerados com vírus. Apesar de nãorepresentar fidedignamente variáveis que poderiam ocorrer na interação vírus–mosquito foi um processomais rápido e que não necessitou de culturas celulares nem níveis altos de biossegurança.Após a análise molecular, os dados gerados foram repassados à central de geoprocessamento paraa geração de mapas que associam a informação da flutuação na população vetores com a circulaçãoviral. Esses mapas são fundamentais para identificação de hot spots, ou seja, regiões com grande capturado vetor e circulação viral e, consequentemente, com alto risco de epidemia.12.4 ResultadosApós padronização da metodologia de extração de RNA e ajuste da estrutura laboratorial e treinamentodo pessoal para lidar com o grande volume de amostras mensal, foram coletadas e analisadas amostrasa partir do mês de junho de 2008. Para fins práticos e por questões de sigilo, esse relatório apresentaráapenas os dados referentes aos meses de junho, julho, outubro e novembro de 2008.Após a padronização da metodologia, foram analisadas as amostras entre junho e novembro de2008, totalizando 5178 mosquitos (516 amostras). Das 516 amostras analisadas, 10 estavam positivaspara DENV (1,94%). Nesses cinco meses de análises foram encontrados amostras positivas para DENV-1,DENV-2 e DENV-3, sendo que houve regiões onde foi registrado dupla positividade, presença de mais deum sorotipo. A partir dessas informações foram gerados mapas de georreferenciamento que apontavamas regiões onde havia circulação de Dengue virus. Posteriormente, foram gerados os mapas de hot spots, emque havia maior risco de epidemia por haver tanto grande captura de vetor como circulação viral.A seguir, seguem as imagens dos géis com amostras positivas para DENV e os respectivos mapasgerados pelo sistema de georreferenciamento.