Faglig rapport 2005 - Helse Vest

Forskningsprosjekt 911006:Fosfoprotein-proteomikk for identifikasjon av nyebehandlingsmålProsjektansvarlig: Kari Espolin Fladmark (kari.fladmark@pki.uib.no), Universitetet i BergenFosfoprotein-proteomikk i identifikasjon av nye behandlingsmål.30 % av akutt myelogen leukemi pasienter har mutasjon i tyrosinkinase-reseptoren Flt3.Det arbeides med å kartlegge hvilken betydning disse mutasjonene har for funksjonen avFlt3. Vha massespektrometri identifiseres endringer i Flt3 og bindingspartnere av Flt3. Decellulære signalveiene som settes i gang av Flt3 blir kartlagt.Flt3 er en transmembran tyrosinkinase-reseptor som er mutert i 30 % av pasienter med akuttmyelogen leukemi (AML). Mutasjonene er forbundet med dårlig prognose. Mutasjonene finnes som enintern tandem duplikasjon (ITD) i området rett under cellemembranen, eller som punktmutasjon/delesjon i det aktive setet. Mutasjonene fører til at kinasen har ligand-uavhengig aktivitet. Ved hjelpav etablert diagnostikk ved HUS, har vi analysert over 200 pasienter for mutasjoner i Flt3 på gennivå,og funnet 58 pasienter med ITD og 13 med aktivt setemutasjon.Deteksjon av mutasjon i et gen gir ikke noen direkte informasjon om hvorvidt mutasjonen endrerproteinets opprinnelige funksjon og dermed også signaliseringen i cellen. Ved ITD finner vi en storvariasjon i lengden på duplikasjonen og sekvensområdet som dupliseres. For å undersøke hvorvidtdenne heterogeniteten blant mutasjonene gir forskjeller i cellenes molekylære signalveier, har vi kjørt48 prøver fra disse pasientene på RNA ekspresjons matiser og holder for tiden på å bearbeide dissedataene.I fremtidens målrettede behandling ønsker man å hemme spesifikke signalveier i cellene. Signalveienesom aktiveres av mutert Flt3 er ikke kjent og vi ønsker å bruke proteinanalyse (proteomikk) for åkartlegge disse.Som modellsystem har vi laget ulike konstrukter basert på mutasjonene vi har funnet ipasientmaterialet og klonet disse inn i retroviral vektor. Ved transfeksjon av ulike cellelinjer mednormal Flt3 viser det seg at cellene dør. Dette funnet er overraskende da Flt3 i følge litteraturenhindrer celledød og fremmer overlevelse. Mekanismen og årsaken til dette fenomenet blir nåundersøkt. Dette har komplisert opprettelse av stabile cellelinjer og vi har nå tatt i bruk en vektor hvorvi kan regulere Flt3 ekspresjonen.Vi arbeider med å kartlegge signalveier indusert av ligand og mutert Flt3 ved å identifiserefosforyleringssetene i Flt3 reseptoren og samtidig hvilke proteiner som binder til reseptoren. Vi haroptimalisert metoder for å kunne fiske ut store mengder av både Flt3 reseptor og bindingspartnerne.Vi har identifisert ligandavhengige bindingspartnere av Flt3. Ved hjelp av mutasjonsstudier arbeider vinå med å kartlegge bindingsområdet til disse Flt3 partnerne.Vi forsøker også å kartlegge signalveiene nedstrøms. Immunopresipitering av tyrosinfosforylerteproteiner er benyttet og prøver fra disse forsøkene kjøres nå på LC-MS (liquid chromatography massspectrometry). Videre har vi benyttet kommersiell rekombinant normal/mutert Flt3 til å fosforylerelysat fra leukemicellelinjer. Fra disse forsøkene har vi plukket ut fosfoproteinene som haropp/nedregulert fosforyleringsnivå og holder på med å identifisere disse ved hjelp av MALDI-TOFmassespektrometri.En annen metode vi holder på å etablere er SILAC. Med denne metoden kan vi kvantitativtsammenligne proteinekspresjon mellom 2-3 ulike cellekondisjoner ved hjelp av isotopemerking ogpeptidanalyse. For å benytte SILAC spesifikt til fosfopeptider, tar vi i bruk bestemtefosfopeptidanrikende kolonner og LC – QTOF massespektrometri.172