THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

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Résultats quatre pour le cluster hdc porté par un plasmide. De plus, la putrescine est l’amine biogène majoritaire du vin (Marcobal et al, 2005 ; Mangani et al, 2005). B. La putrescine dans la résistance au stress acide chez O. oeni De même que pour l’étude du rôle de l’histamine dans l’hypothèse de la lutte contre le stress acide chez O. oeni, la fonction de la synthèse de putrescine à également été explorée. Contrairement aux gènes de la voie HDC portés par un plasmide, les gènes de la voie ODC de O. oeni sont localisés au niveau chromosomiques (Marcobal et al, 2004, 2006). La stratégie d’interrompre le gène odc par simple recombinaison homologue a d’abord été tentée. Pour cela le vecteur pGID701 (Oraby, 2002), dérivé du pORI19 a été utilisé. Une région interne de odc a été clonée dans ce vecteur et le pGID701-odc ainsi obtenu (Figure 30) a été transféré dans la souche O. oeni BR14/97 (Guerrini et al, 2002) portant les gènes odc et potE. Des transformants ont été obtenus mais aucun mutants. Cela peut s’expliquer par plusieurs raisons. Tout d’abord, le premier frein à l’obtention de mutants est l’efficacité de transformation qui n’est pas suffisamment élevée par rapport à cette stratégie. Ensuite, la stratégie de mutation par simple recombinaison homologue n’est peut être pas bien adaptée. En effet, lors d’une étude sur l’interruption de gènes par recombinaison homologue chez Thermococcus kodakaraensis, une archée hyperthermophile, Sato et al (2003) n’obtiennent aucune mutation par simple crossing-over. Cependant, une interruption du gène ciblé a été obtenue par double recombinaison. L’échec dans l’obtention de mutant par une approche en simple recombinaison serait dû au clivage par le système de restriction/ modification (RM) de l’ADN circulaire. Les systèmes de RM sont avant tout un moyen de défense des bactéries contre l’ADN hétérologue. Ils regroupent des méthylases et des enzymes de restriction. Chaque souche bactérienne possède un profil de méthylation propre de son ADN, et l’ADN exogène, qui possède un profil de méthylation différent, est dégradé par les enzymes de restriction. Aussi, la méthylation in vitro de plasmides est envisagée pour augmenter l’efficacité de transformation. Ce moyen a permis de transformer Helicobacter pylori (Donahue et al, 2000) ainsi que Bacillus cereus (Groot et al, 2008). Il serait peut être possible d’envisager cette stratégie chez O. oeni. 100
Figure 30. Carte du vecteur suicide pGID701-odc Résultats Face à l’échec dans l’obtention de mutants odc, la stratégie déjà utilisée pour exprimer les gènes de la voie HDC de L. hilgardii chez O.oeni, a été entreprise. Comparé à l’étude précédente, il s’agit d’exprimer les gènes odc et potE d’une souche de O. oeni isolée du vin (Figure 31), dans la souche de laboratoire, dépourvu d’activité ornithine décarboxylase. Ainsi, il ne devrait pas y avoir d’incompatibilité dans la reconnaissance des signaux d’expression. Les gènes odc et potE ont donc été amplifiés à partir de O. oeni BR14/97 (Guerrini et al, 2002) et clonés dans le pGID052 (Figure 32), puis transférés chez O. oeni ATCC BAA-1163. Figure 31. Organisation génétique de la voie de biosynthèse de la putrescine. Les gènes odc et potE ont été clonés dans le pGID052 puis transférés dans la souche O. oeni ATCC BAA-1163 Ensemencée en milieu LAC, la souche témoin O. oeni BR14/97 odc + produit de la putrescine, alors que le clone O. oeni ATCC BAA-1163 contenant le vecteur pGID052- odcpotE n’en produit pas. 101
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RESUME Résumé Les amines biogène
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