THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

D. Construction du vecteur pXT-hisRS
Matériels et méthodes
Le clonage du gène hisRS dans le pXT, en aval du promoteur pxyl inductible en
présence de xylose (20 mM), s’est effectué en deux parties (Figure 19). En effet, seuls les
sites BamHI, EcoRI et HindIII du polylinker du pXT peuvent ête utilsée. Or le gène hisRS
comporte les sites de restriction EcoRI et HindIII. La stratégie a été d’amplifier dans un
premier temps un fragment de 815 pb avec les amorces hisRSHind1 et hisRSEco qui a été
cloné entre les sites HindIII et EcoRI du pXT. Puis la seconde région du gène hisRS,
correspondant à un fragment de 530 pb a été amplifiée avec les amorces hisRSBam et
hisRSHind2, et clonée entre les sites BamHI et HindIII du vecteur recombinant obtenu à la
première étape. Le vecteur pXT-hisRS ainsi construit (1 µg) a été transféré chez E. coli. Les
clones obtenus sont résistants à l’ampicilline (100 µg.mL -1 ).
Figure 19. Stratégie de clonage du gène hisRS dans le pXT en deux parties.
E. Intégration du pDL-hdcP et pDL-hdcAB dans le génome de
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Le pDL s’intègre au site amyE (α-amylase). La vérification de la double intégration
s’effectue sur milieu amidon. En effet, la gélose à l’amidon est utilisée pour mettre en
évidence l’activité amylase caractéristique de certaines espèces du genre Bacillus. Elle est
constituée de 15 g.L -1 d’agar, 10 g.L -1 d’amidon, 5 g.L -1 de chlorure de sodium, 2 g.L -1
d’extrait de levure, 1 g.L -1 d’extrait de viande et 5 g.L -1 de peptone.
Après transformation avec 1 µg des vecteurs pDL-hdcP et pDL-hdcA, 20 à 200 µL de
cellules transformées sont étalées sur milieu LB contenant 5 µg.mL -1 de chloramphénicol. Les
clones obtenus sont ensuite repiqués sur un milieu identique et en parallèle sur la gélose à
l’amidon préparée la veille. Après 24h d’incubation à 37°C, les géloses à l’amidon sont
inondées de lugol. Le lugol colore l’amidon en brun-noir et l’apparition d’un halo décoloré
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