THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

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Discussion-Perspectives en position 620 fait place à un résidu polaire, l’asparagine. Mis à part le dernier cas, ces changements n’affectent pas la nature de l’acide aminé. En outre, ces résidus ne semblent pas intervenir dans la fonctionnalité de l’enzyme. Le travail de caractérisation in vitro a été poursuivi au laboratoire, afin de définir les acides aminés ayant un rôle clé dans la reconnaissance et la liaison au substrat, ainsi que dans le site catalytique. En s’appuyant sur les études cristallographiques réalisées chez Lactobacillus 30a (Momany et al, 1995 ; Vitali et al, 1999), nous avons donc identifiés plusieurs résidus d’intérêt : la glycine 141, impliquée dans l’association de dimères en dodécamères, la lysine 374 auquel le pyridoxal-5’-phosphate est lié covalemment via une base de Schiff, et l’acide glutamique 551 qui interagit avec la L-ornithine dans le site actif (Tableau 11). Tableau 11. Mutagenèse d’acides aminés (AA) d’intérêt de l’ODC de O. oeni à muter. Le choix ces cibles est basé sur les études réalisées chez Lactobacillus 30a (Momany et al, 1995 ; Vitali et al, 1999). Les séquences protéiques de Lactobacillus 30a et O. oeni sont homologues à 68%. AA ODC O. oeni Mutation envisagée Choix de la mutation Gly 141 Tyr 141 Relatif au mutant G121Y de Lactobacillus 30a (Vitali et al, 1999) Lys 374 Glu 374 Inversion des charges (+ → -) Glu 551 Lys 551 et Ala 551 Inversion des charges (- → +) (Lys) ou remplacement par un AA apolaire (Ala) La mutation du résidu Lys 374 en Glu 374 a été réalisée, par mutagénèse dirigée, à partir du vecteur pET28a-odc. Le principe de cette technique repose sur la modification d’un codon par amplification par PCR avec des amorces contenant des substitutions ou modifications de nucléotides. La caractérisation de ce mutant est en cours, et la construction des autres se poursuit. Peu de protéines ont été caractérisées chez O. oeni, hormis l’histidine décarboxylase (Coton et al, 1998), et Hsp18 (Coucheney, 2005), une protéine de stress. La 144
Discussion-Perspectives plupart du temps ce sont les gènes qui sont caractérisés, comme ceux liés au catabolisme de l’arginine (Tonon et al, 2001 ; Divol et al, 2003), mlA codant l’enzyme malolactique (Labarre et al, 1996), et d’autres gènes codants des protéines de stress tels que clpL, clpX, omrA, trxA (Beltramo et al, 2004b ; Jobin et al, 1999a ; Bourdineaud et al, 2004 ; Jobin et al, 1999b). Ainsi, la caractérisation de l’ODC vient compléter les connaissances sur le métabolisme de ce microorganisme. Partie III Les amines biogènes peuvent être produites par les bactéries lactiques à partir de différentes sources azotées. Les expériences issues de mon travail de thèse montrent en effet que les acides aminés libres ne sont pas les seuls précurseurs, mais que L. plantarum est capable d’utiliser des peptides synthétiques contenant la tyrosine, afin de synthétiser la tyramine. De plus, ces peptides sont dégradés dans le milieu extracellulaire. Cependant, l’étude concernant le rôle des peptides dans la production d’amines biogènes n’est pas terminée. En effet, d’une part, il faudrait déterminer l’expression de la tyrosine décarboxylase, afin de la comparer à l’expression du transporteur, dans les deux conditions testées (en présence de peptides ou de tyrosine libre). Bien que les gènes tdc et tyrP semblent être co- transcrits, leurs profils d’expression n’est pas forcément identique. D’autre part, le produit de RT-PCR correspondant à l’amplification des deux gènes devrait être séquencé. Il y a actuellement peu de données chez L. plantarum concernant le métabolisme de la tyramine, alors qu’il s’agit d’un fort producteur. Seulement une étude relate le clonage partiel de la tyrosine décarboxylase (Arena et al, 2007). De plus, il n’y a pas de séquence disponible pour le gène codant le transporteur dans les banques de données génomiques. A propos des autres Lactobacilles, le gène de la tdc a été entièrement séquencé chez Lactobacillus brevis (Lucas et al, 2002) et Lactobacillus curvatus, et ces deux séquences présentent un pourcentage de similarité de 73% (Cf. alignement, Annexe 2). Le séquençage de la tyrosine décarboxylase de L. plantarum et de son transporteur, permettrait ensuite le développement d’outils moléculaires pour la détection des souches de L. plantarum productrices de tyramine. Outre L. plantarum, ce type d’expérience pourrait être conduit sur d’autres genres bactériens producteurs de tyramine. Egalement la synthèse d’histamine et de putrescine pourrait être testée, en utilisant des peptides contenant de l’histidine ou de l’arginine, avec des souches hdc + ou AgDI + . Dans les expériences réalisées, j’ai utilisé un mélange de trois peptides, avec une place déterminée pour la tyrosine (en N-terminal, en C-terminal ou au 145
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