THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Spermidine
Spermine
Chapitre II : étude de l’ODC de O. oeni
I. Purification de l’ornithine décarboxylase de O. oeni
Matériels et méthodes
Les cellules de E. coli BL21 contenant le vecteur pET28a-odc sont cultivées en milieu
LB avec 50 µg.mL -1 de kanamycine. Un litre de LB est ensemencé à DO600nm = 0,05. A
DO600nm = 0,7, 50 µM d’IPTG sont ajoutés et la culture est placée à 15°C sous agitation
pendant une nuit. La culture est divisée en deux puis centrifugée pendant 5 min à 5000 rpm.
Un culot est conservé à -20°C, tandis que l’autre est repris dans 7 mL de tampon NaH2PO4 à
50 mM, NaCl 300 mM, pH8. Le culot est ensuite cassé au disrupteur (référence disrupteur,
One shot…..) à 1,4 kBars. Les débris cellulaires sont enlevés par centrifugation pendant 10
min à 10 000 g à 4°C. Le surnageant contenant l’enzyme est toujours conservé dans la glace
durant le reste de la purification. Dans une colonne de purification, reliée à une pompe
péristaltique, est versé 2 mL d’agarose Ni-NTA (Qiagen). Puis, la colonne est équilibrée avec
du tampon NaH2PO4 (environ 20 mL) décrit précédemment. Le surnageant est ensuite déposé
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