THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Annexes
Afin de vérifier l’efficacité du transfert, le gel est coloré au Bleu de Coomassie et la
membrane est colorée au rouge Ponceau.
Hybridation avec les anticorps
Les sites non-spécifiques de la membrane sont saturés dans du tampon PBS –lait (137
mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,2 ; 5% lait écrémé p/v)
pendant 30 min. Ensuite, la membrane est lavée trois fois avec du PBS-Triton 100 (0,2% v/v)
pour éliminer l’excès de caséine. La membrane est ensuite incubée dans du tampon PBS-lait-
Triton (lait 5% v/v, Triton 0,2% v/v) pendant une heure avec l’anticorps monoclonal anti-
polyHistidine de souris (Sigma-Aldrich) dilué au 1/2000 et directement couplé à la péroxidase
(horseradish). Après trois lavages de la membrane dans du PBS-triton, la révélation est
effectuée.
Révélation du blot avec le kit ECL (Enhanced Chemiluminescence detection)
La révélation est basée sur l’émission de lumière pendant la réaction produite lors de
l’ajout des deux réactifs du kit ECL (GE Healthcare) avec la péroxidase. Le kit contient deux
produits : le luminol et une solution de péroxide. Les solutions sont mélangées à température
ambiante (v/v) puis versés sur la membrane. Après 1 min d’incubation, la membrane est
égoutée puis emballée dans un film alimentaire. La lumière émise est ensuite capturée sur un
film autoradiographique en chambre noire.
Construction d’un vecteur suicide pour la mutation du gène mleP de O. oeni
Un vecteur suicide nommé pmlePERY a été construit afin de muter le gène mleP de O.
oeni par double recombinaison homologue. Les régions en amont et en aval de mleP ont été
clonées dans le pUC18, de part et d’autre d’une casette conférant la résistance à
l’érythromycine. Le pUC18 est un vecteur de clonage à haut nombre de copies chez E. coli,
contenant une origine de réplication reconnue uniquement chez les bactéries à Gram négatif.
Il ne peut donc pas se répliquer chez les bactéries à Gram positif. Une région de 1012 pb en
amont de mleP a été amplifiée avec les amorces mleP3 et mleP4, puis clonée dans le pUC18
entre les sites KpnI et EcoRI. Puis une région de 1031 pb en aval de mleP a été amplifiée avec
les amorces mleP5 et mleP6 et cloné dans le pUC18 entre les sites HindIII et BamHI. Ensuite,
le pUC18 a été digéré par SmaI, un site du polylinker situé entre les deux régions amont et
aval de mleP. Enfin, la casette erm R , digérée aux extrémités par PvuII a été clonée au site
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