THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Annexes
mécanismes, en particulier ceux relatifs à la famille des auxines. Mais l’étude fonctionnelle
des gènes de O. oeni, passe par une maîtrise de la manipulation génétique de cette bactérie.
D’une part, nous ne disposons pas d’outils permettant de muter cette bactérie, d’autre part,
l’expression des gènes de O. oeni en système hétérologue est difficile à mettre en place, au
regard des échecs obtenus. En ce qui concerne l’expression de transporteurs, cela peut
s’expliquer par exemple, par un mauvais adressage et repliement des protéines dans la
membrane.
MATERIELS ET METHODES
Obtention des plasmides pNZmleP, pNZmaeP et pNZyaeP à partir de L. lactis NZ9000
Des précultures sont réalisées à partir du stock glycérol de L. lactis NZ9000 contenant
les vecteurs pNZmleP, pNZmaeP ou pNZyaeP en M17 et chloramphénicol 10 µg. µL -1 . Afin
d’extraire les plasmides, 2 mL de culture sont centrifugés pendant 1 min à 12.000 rpm. 200
µL de tampon 1 (kit GeneElute Plasmid Miniprep, Sigma) sont ajoutés ainsi que 10 mg.mL -1
de lysozyme. La réaction est incubée 15 min à 50°C, puis l’extraction est poursuivie selon les
recommandations du fournisseur (Sigma).
Préparation de cellules compétentes pour L. plantarum
Cinq cent mL de milieu MRS préchauffé à 37°C sont inoculé à DO600nm= 0,15 à partir
d’une préculture réalisée 24h avant l’ensemencement. La culture est incubée statiquement à
37°C. A partir de DO600nm= 0,65, la culture est centrifugée à 6.000 g pendant 10 min à 4°C
puis le culot est resuspendu dans 500 mL d’eau MilliQ stérile à 4°C. Le lavage est répété une
fois. Puis les celllules sont resuspendues dans 1,5 mL de PEG 1500 (300 g.L -1 ).
Electroporation de L. plantarum
Cent µL de cellules compétentes sont électroporées en présence de 1 µg de plasmide.
Les paramètres électriques sont les suivants : 2200 V, 100Ω, 25 µF. Après le pulse, les
cellules sont conservées 20 min dans la glace, puis 500 µL de MRS sont ajoutés. Après
incubation à 37°C pendant 3h, une partie des cellules (10 à 100 µL) est étalée sur milieu
sélectif contenant du chloramphénicol à 10 µg. µL -1 .
Outre les trois vecteurs d’étude contenant les gènes mleP, maeP et yaeP de O. oeni, le
vecteur pNZ8048 dans lequel a été cloné le gène mleP de L. lactis est également introduit
153