THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Matériels et méthodes
A. Construction des vecteurs pGID052-hdcAB et pGID052hdcPAB
Les vecteurs pGID052-hdcAB et pGID052-hdcPAB contiennent respectivement les
gènes hdcA et hdcB ou les gènes hdcP, hdcA et hdcB de Lactobacillus hilgardii 0006,
impliqués dans la production d’histamine.
1) Construction du vecteur pGID052-hdcAB
Le fragment hdcAB de 2198 pb a été amplifié avec les amorces hdcA5’-2 et hdcB3’-2,
à l’aide de la Taq haute fidélité (Roche) ; puis cloné dans le pCR2.1-TOPO (Invitrogen),
selon les recommendations du fournisseur. Après transformation des bactéries E. coli Match 1
(fournies avec le kit), les cellules sont étalées sur milieu LB contenant 100 µg.mL -1
d’ampicilline, en présence de X-gal (40 µg.mL -1 ), ce qui permet une sélection blanc/bleu des
clones. Les clones obtenus sont repiqués, puis une minipréparation d’ADN plasmidique est
effectuée. Les plasmides sont vérifiés par PCR puis séquençage. Le clone pTOPO-hdcAB
obtenu est ensuite digéré par SmaI et SacI, et le fragment hdcAB est excisé sur gel et purifié.
Il est ensuite cloné dans le pGID052, digéré préalablement par SacI et SmaI. Les bactéries E.
coli EC101 électrocompétentes sont électroporées avec 1/5 ème de la réaction de ligation, puis
étalées sur milieu LB contenant 250 µg.mL -1 d’érythromycine.
2) Construction du vecteur pGID052-hdcPAB
Le clonage du fragment hdcPAB contenant 3958 pb, de L. hilgardii 0006 dans le
pGID052, s’est effectué en deux parties (Figure 17). Dans un premier temps un fragment A de
1446 pb correspondant à hdcP a été amplifié à partir de l’ADN de Lactobacillus hilgardii
0006 avec les amorces A5’ et A3’, et un second fragment B de 2512 pb correspondant à hdcA
et hdcB a été amplifié avec les amorces B5’ et B3’. Ces deux fragments (A et B) ont ensuite
été clonés dans le pCR-XL-TOPO (Invitrogen) suivant les recommandations du fournisseur.
Les clones portant les plasmides recombinants pTOPO-hdcP et pTOPO-hdcAB ont été
sélectionnés après vérification des inserts par PCR et séquençage (Beckman Coulter
Genomics). Puis le vecteur pTOPO-hdcP a été digéré par les enzymes SalI et KpnI tandis que
pTOPO-hdcAB a été digéré par KpnI et SacI. Les fragments hdcP et hdcAB ont ensuite été
séparés sur gel d’agarose 0,9%, les bandes correspondantes ont été découpées et purifiées
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