THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

II. Criblage des souches productrices d’amines biogènes
Matériels et méthodes
Afin de tester l’aptitude des souches à produire des amines biogènes, le milieu décrit
par Bover-Cid & Holzapfel (1999) contenant un indicateur de pH, a été utilisé pour certaines
bactéries lactiques (Figure 16).
Figure 16. L. hilgardii 0006 (Lucas et al, 2005) producteur d’histamine, dans le milieu de
Bover-Cid & Holzapfel (1999) contenant du pourpre de bromocrésol comme indicateur
coloré. A gauche: tube ensemencé avec L. hilgardii 0006 : le milieu vire au mauve du à
l’activité décarboxylase qui induit une alcalinisation du pH. A droite : milieu avant
ensemencement.
III. Extraction d’ADN
Ce protocole a été appliqué à Lactobacillus hilgardii 0006. La bactérie est ensemencée
à DO600nm = 0,05 dans 15 mL de milieu CarrM (composition décrite ci-dessus). Au bout de 24
h la culture atteint la phase exponentielle. Les cellules sont récoltées en phase exponentielle
(DO600nm = 1). Le culot cellulaire est ensuite lavé avec 500 µL du tampon contenant: 50 mM
de Tris-HCl pH8, 50 mM de NaCl, 5 mM EDTA et 25% (p/v) de sucrose. Après une
centrifugation de 5 min à 10000 g, le culot est resuspendu dans 200 µL du même tampon
contenant 40 mg.mL -1 de lysozyme. Après une incubation d’une heure à 37°C, 400 µL d’une
solution fraîchement préparée de NaOH à 0,2 M à 1% SDS sont ajoutées. Puis, une seconde
incubation d’une heure à 37°C est réalisée. La lyse est stoppée avec 300 µL d’une solution
glacée d’acétate de potassium 3M, pH 4,8. Une centrifugation de 5 min à 8000 g est
nécessaire pour enlever les débris cellulaires. Le surnageant est transvasé dans un tube propre
et une extraction au phénol/ chloroforme est réalisée. 900 µL de phénol/chloroforme/IAA
(alcool isoamylique) est ajouté, puis le mélange est vortexé et centrifugé à 4°C pendant 15
min à 15000 g. La phase aqueuse supérieure (environ 600 µL) où se trouve l’ADN est
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