THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

10X)
Matériels et méthodes
Tableau 6. Protocole pour la réalisation d’une PCR avec la Taq Haute Fidélité Roche.
Constituants
Quantités pour
un tube PCR
Expand High Fidelity Buffer (10X) with 15 mM
MgCl2 5 µL
dNTP Mix 10 mM (Fermentas) 1 µL
Amorce Forward 20 µM (Eurogentec) 1 µL
Amorce Reverse 20 µM (Eurogentec) 1 µL
Expand High Fidelity Enzyme (100 U) 0,75 µL (2,6 U)
ADN 15 ng
Eau MilliQ qsp 50 µL
Le programme de la réaction d’amplification est le suivant :
Dénaturation initiale : 94°C, 2 min (1X)
Dénaturation : 94°C, 15 s
Hybridation : 45 à 65°C, 30 s (dépend de la température de fusion des amorces)
Elongation : 68 ou 72°C, 45 s à 8 min (pour les fragments PCR jusqu’à 3 kb, la
température d’élongation est de 72°C, pour les fragments de taille supérieure, la température
est de 68°C). La durée d’élongation dépend de la taille du fragment (ex : 1 min pour 1,5 kb)
Elongation finale : 72°C, 7 min (1X)
Les étapes de dénaturation, d’hybridation et d’élongation sont d’abord répétées dix fois, puis
les mêmes étapes sont répétées 20 fois en augmentant le temps d’élongation de 5 s pour
chaque cycle successif.
V. Préparation de bactéries compétentes
A. Escherichia coli électrocompétentes
Cinq cent mL de milieu LB sont ensemencés à DO600nm=0,05 et incubés à 37°C sous
agitation. En phase exponentielle (DO600nm=0,5), les cellules sont centrifugées 10 min à 5000
g et à 4°C puis lavées trois fois en eau stérile froide et enfin, en glycérol (10%). Les cellules
sont ensuite resuspendues dans 2 mL de glycérol (10%) et stockées à -80°C en fractions
aliquotes de 100 µL. Les cellules sont électroporées dans une cuvette Gene Pulser de 0,2 cm
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