THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

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Annexe 1 INTRODUCTION Annexes Une partie de ma thèse s’est focalisée sur la suite des travaux de thèse de Yoann Augagneur qui a participé au précédent programme européen FP5 n° QLKI-CT-2002-02388, visant à étudier le métabolisme du L-malate et du L-citrate chez Oenococcus oeni et Lactococcus lactis. Les travaux de cette partie du programme européen ont été supervisés par Dominique Garmyn, en tant que responsable scientifique. Les recherches concernant O. oeni étaient à poursuivre dans le projet FP7 BiamFood. Chez O. oeni et L. lactis, la fermentation de l’acide malique génère à la fois un gradient transmembranaire de pH, alcalin à l’intérieur, et un gradient de potentiel électrique, négatif à l’intérieur (Salema et al, 1996 ; Poolman et al, 1991). Concernant le métabolisme du citrate, il a été montré que le transporteur CitP de Leuconostoc mesenteroides est également impliqué dans la génération d’un potentiel de membrane via l’échange citrate/lactate (Marty- Teysset et al, 1995 ; Bandell et al, 1997). A partir de la séquence du gène mleP de O. oeni, codant un transporteur de L-malate de la famille des auxines, deux autres gènes putatifs codant des transporteurs du L-malate et du L-citrate ont été identifiés : maeP et yaeP. L’expression de ces trois gènes a été étudiée en système hétérologue, d’une part, chez E. coli et, d’autre part, chez L. lactis. Ces deux microorganismes sont largement employés pour l’étude fonctionnelle de protéines. En particulier depuis la mise au point d’un système d’expression régulé par ajout de nisine chez L. lactis (Kuipers et al, 1995 ; De Ruyter et al, 1996 ; Mierau & Kleerebezem, 2005) (cf schéma), des transporteurs procaryotes et eucaryotes ont pu être exprimés et caractérisés (Kunji et al, 2003). Mais dans le cas des gènes de O. oeni , l’expression hétérologue chez E. coli avec induction à l’arabinose ou chez L. lactis avec induction à la nisine n’a pas permis de déterminer la fonctionnalité des transporteurs. Pourtant, la protéine MleP a été détectée par Western blot chez E. coli, mais ce transporteur n’exhibait pas une activité suffisante. En fait, les conditions de production et d’insertion de la protéine dans la membrane n’étaient pas optimales (Augagneur, 2007). En conclusion de ces travaux, l’hypothèse de tester l’expression chez un hôte, phylogénétiquement proche de O. oeni, a été soulevée. En effet, le système NICE (NIsin-Controlled gene Expression) (Figure 1), décrit ci-dessus, peut être utilisé chez L. plantarum suite aux travaux de Pavan et al (2000) qui ont intégré les gènes de régulation nisRK de L. lactis dans le chromosome de L. plantarum NCIMB8826. Le fait 148
Annexes d’utiliser cet hôte pourrait optimiser l’expression et l’insertion du produit de cette expression dans la membrane bactérienne, car L. plantarum est proche de O. oeni au niveau phylogénique. Lors de l’étude de l’expression des gènes de O. oeni chez L. lactis NZ9000, Yoann Augagneur avait crée dans le pNZ8048 une fusion traductionnelle entre la phase codante des gènes mleP, maeP ou yaeP de O. oeni et 6 codons histidine. Ces constructions plaçaient les gènes de O. oeni sous le contrôle du promoteur PnisA permettant la synthèse d’une protéine étiquetée par des résidus histidine dans sa région amino-terminale. Les trois plasmides ainsi construits ont été nommés : pNZmleP, pNZmaeP et pNZyaeP. Dans un premier temps, ces trois plasmides ont été transférés chez L. plantarum NCIMB8826, afin de caractériser les transporteurs. Dans une deuxième partie, une stratégie de mutation par double recombinaison homologue a été développée pour muter ces transporteurs, afin de compléter l’étude sur la fonctionnalité des transporteurs du malate et du citrate chez O. oeni. Figure 1. Schéma d’activation de l’expression de gènes par le système NICE 149
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Introduction Pour faire face à ce
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1) Quantification des amines biogè
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Chapitre II : Les outils moléculai
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II. Criblage des souches productric
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