THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

RESULTATS
Annexes
Les transporteurs impliqués dans le transport des acides organiques chez les bactéries
lactiques, sont des transporteurs secondaires qui utilisent l’énergie libre stockée sous forme de
gradient ionique et/ou de solutés à travers la membrane. Chez L. lactis et Leuconostoc
mesenteroides, les transporteurs d’acides organiques appartiennent à la famille des 2-
hydroxycarboxylate (2-HCT). Tandis que le transporteur du L-malate mleP de O. oeni
appartient à la famille des auxines (Sobczak & Lolkema, 2005). Des études ont montré de
fortes ressemblances dans le transport du L-malate et du citrate chez O. oeni. En effet, le
transport de ces deux acides organiques est inhibé par le potentiel de membrane et favorisé
par le gradient de pH (Salema et al, 1994). Ainsi, MleP serait à la fois le transporteur du L-
malate et du citrate chez O. oeni. A partir de la séquence de MleP de O. oeni et à l’aide des
génomes séquencés, d’autres séquences codants des transporteurs putatifs d’acides organiques
ont été identifiées. Ce travail vise donc à explorer la fonctionnalité de ces transporteurs. Deux
stratégies ont été employées : la surexpression chez L. plantarum et la mutagénèse dirigée.
Cette dernière approche a nécessité le développement d’un vecteur suicide.
Induction de l’expression des transporteurs mleP, maeP et yaeP de O. oeni à la nisine
Afin de surproduire les transporteurs du malate et du citrate de O. oeni chez L.
plantarum, des mises au point ont tout d’abord été effectuées. Le vecteur pNZ-mleP de L.
lactis, contenant le transporteur mleP de L. lactis, a servi de vecteur témoin pour le
développement des conditions d’expression. Différentes gammes de concentration en nisine
ont été testées : de 0 à 500 ng.mL -1 et de 0,1 à 15 ng.mL -1 et l’induction de l’expression a été
réalisée à différent moment de la croissance (DO600nm : de 0,2 à 0,5). L’expression du
transporteur mleP de L. lactis dans la souche L. plantarum NCIMB8826 est détectée par
Western Blot lorsque l’induction est réalisée en présence de 50 ng.mL -1 de nisine à DO600nm =
0,35. L’analyse par immuno-détection permet de visualiser la protéine MleP de L. lactis qui a
une masse moléculaire de 46,7 kDa (Figure 2). En ce qui concerne les transporteurs de O.
oeni : mleP, maeP et yaeP aucune bande n’est visible dans les mêmes conditions de culture.
Ce travail montre la difficulté à exprimer des protéines, en particulier des transporteurs de O.
oeni en système hétérologue. Les tentatives d’expression chez L. lactis et L. plantarum ont
échouées. Tandis que chez E. coli, la production de MleP est toxique, car sa présence à la
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