THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Matériels et méthodes
(BioRad), à l’aide d’un électroporateur Gene Pulser Xcell BioRad selon les paramètres
suivants : 2,5kV, 200Ω et 25µF. Après avoir administré la décharge électrique, 1mL de milieu
LB est ajouté aux cellules puis la suspension cellulaire est incubée 1h à 37°C sous agitation
avant d’être étalée sur milieu sélectif gélosé.
B. Bacilus subtilis compétentes
Dix mL de milieu LB sont ensemencés à DO600nm= 0.2 et incubés à 37°C. A
DO600nm=1 ; 500 µL de pré-culture sont dilués dans 10 mL de MD medium composé de : 9,2
mL de MN1X (KH2PO4 44 mmol, K2HPO4 60 mmol et citrate trisodium 3,8 mmol), 0,4 mL
de glucose 50%, 0,5 mg de L-tryptophane, 0,1 mg de citrate d’ammonium ferrique et 0,03
mmol de MgSO4. Après 4H d’incubation à 37°C, la culture est centrifugée 10 min à 5000
rpm. 1,2 mL de surnageant est prélevé et mélangé à 0,3 mL de glycérol 85%. Le culot est
resuspendu dans 1 mL de cette solution contenant le surnageant glycerolé, puis les cellules
sont réparties en fractions aliquotes de 100 µL et congelées à -80°C.
Pour la transformation, les cellules sont resuspendues dans 900 µl de MD medium. Deux cent
cinquante µL sont mise en présence d’ADN (1 µg) puis incubée à 37°C pendant 30 min.
Après ajout de 100 µL de LB, une seconde incubation de 45 min à 37°C a lieu avant d’étaler
20 à 200 µL sur milieu sélectif gélosé.
C. Oenococcus oeni électrocompétentes
O. oeni est ensemencé en milieu FT80 ou en LAC à une DO600nm = 0,025 à 0,05. Les
cellules sont récoltées à DO600nm =0,2, centrifugées et lavées trois fois en tampon contenant
0,5M de saccharose et 10% de glycérol à température ambiante. Le culot cellulaire est ensuite
repris dans 100 µL de tampon d’électroporation à pH 6,5 (Variot, 2010), composé de 5 mM
de KH2PO4, 0,2 mM de MgCl2, 10% de glycérol et 15% d’éthanol absolu. Après ajout de 1µg
d’ADN, les cellules sont électroporées selon les paramètres suivants : 2,4 kV, 200 Ω, 25 µF.
Immédiatement après le choc électrique, 1 mL de milieu FT80 ou LAC contenant 0,5 M de
saccharose est ajouté. Après 4 h d’incubation à 28°C, les cellules sont étalées sur milieu
sélectifs gélosé (10 µg.mL -1 d’érythromycine, 10 µg.mL -1 de lincomycine et 10 µg.mL -1 de
vancomycine). Les transformants apparaissent après 10 jours d’incubation. Pour éviter les
contaminations, notamment par les moisissures, du Delvocid (Humeau, France), composé de
71