THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

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Matériels et méthodes avec le kit Gel Purification (Sigma). Le vecteur pGID052 a été digéré par les enzymes SalI et SacI puis purifié à l’aide du kit PCR Clean up (Sigma). La réaction de ligation s’est ensuite effectuée en présence des trois partenaires : le vecteur et les deux fragments à cloner pendant 24h à 16°C. Après dialyse sur un filtre de 0,025 µm (Whatman), 1/5 de la réaction de ligation, soit 4 µL ont été utilisés pour transformer E. coli EC101. Les cellules électroporées (environ 1,1 mL de volume final) sont étalées sur milieu LB agar contenant 250 µg.mL -1 d’érythromycine. Le vecteur obtenu est appelé pGID052-hdcPAB. Figure 17. Stratégie de clonage des gènes hdcP, hdcA et hdcB. Les fragments A et B sont d’abord sous-clonés dans le pCR-XL-TOPO, avant d’être clonés dans le pGID052. B. Construction du vecteur pGID052-odcpotE Le vecteur pGID052-odcpotE contient les gènes odc et potE de O. oeni BR14/97, impliqué dans la production de putrescine. Il a été obtenu suivant une stratégie similaire à la construction du vecteur pGID052-hdcPAB. Le fragment odc-potE de 4160 pb de O. oeni BR14/97 a été cloné en deux parties (Figure 18). Tout d’abord un premier fragment A de 1829 pb correspondant à la région 5’ du gène odc, et un second fragment B de 2352 pb correspondant à la région 3’ du gène odc et au gène potE ont été clonés dans le pCR-XL- TOPO (Invitrogen). Les amorces ODC1 et ODC3 ont servi à l’amplification du premier fragment (A), tandis que le second fragment (B) à été amplifié en utilisant le couple POTE1 et POTE2. Les amorces ODC3 et POTE1 possèdent le site de restriction PstI présent dans le gène odc. Les clones recombinants ont été nommés pTOPO-odc et pTOPO-potE. Le premier a été digéré par BamHI et PstI et le second par PstI et SacI, afin de récupérer les fragments pour le clonage dans le vecteur d’intérêt. Le pGID052 digéré par BamHI et SacI a servi à la 74
Matériels et méthodes réaction de ligation avec les deux fragments purifiés. Le vecteur ainsi créé est nommé pGID052-odcpotE et propagé dans E. coli EC101. Comme précédemment, 1/5 ème de la réaction de ligation est utilisée pour électroporer les cellules E. coli compétentes. La totalité des cellules électroporées est étalée sur boîtes LB contenant 250 µg.mL -1 d’érythromycine. Figure 18. Stratégie de clonage des gènes odc et potE. C. Construction des vecteurs pDL-hdcP et pDL-hdcAB Une région de 315 pb en amont du gène hdcP a été amplifiée par PCR avec les amorces hdcP5’ et hdcP3’. Le fragment obtenu a ensuite été cloné entre les sites SalI et SspI du vecteur pDL pour donner le pDL-hdcP. Le pDL-hdcAB a été construit par clonage d’un fragment de 297 pb correspondant à la région promotrice de hdcA, située entre le codon stop de hdcP et le codon start de hdcA. Les amorces utilisées sont phdcAB5’ contenant un site EcoRI et phdcAB3Bis contenant un site BamHI. Les vecteurs pDL-hdcP et pDL-hdcAB sont ensuite transférés chez E. coli. Les transformants sont sélectionnés sur milieu LB contenant 100 µg.mL -1 d’ampicilline. 75
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Résultats splitter (split ratio =
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Table 1: Oligonucleotides used in t
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Table 2: Identification of amines b
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Résultats strains, do not carry th
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Résultats (Strahinic et al, 2009),
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Résultats Duary RK, Batish VK & Gr
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Résultats Nannelli F, Claisse O, G
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curvatus AGCTGGTAAAGTAACGGTTCTTCGGG
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RESUME Résumé Les amines biogène
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