THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Révélation du gel
Matériels et méthodes
Après migration des échantillons protéiques, le gel est coloré une nuit dans une solution
composée de : 50 mg de bleu de Coomassie, 40 mL d’éthanol, 20 mL d’acide acétique qsp
200 mL d’eau. Il est ensuite décoloré pendant environ 3h dans une solution composée de : 50
mL d’éthanol, 16 mL d’acide acétique qsp 100 mL d’eau.
B. Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976)
La méthode de Bradford permet de mesurer la concentration en protéines par dosage
colorimétrique, en mesurant l’absorbance à 595 nm des acides aminés aromatiques (tyrosine,
tryptophane et phénylalanine). Une gamme d’étalonnage (0 à 15 mg.mL -1 ) est réalisée à partir
de BSA (sérum albumine bovine). Les échantillons sont mélangés au réactif de Bradford
(BioRad) dilué au 1/3 dans un volume final de 1mL. Après une incubation de 15 min à
température ambiante, l’absorbance est mesurée au spectrophotomètre.
II. Mesure de l’activité enzymatique de l’ornithine décarboxylase
L’activité enzymatique est mesurée en tampon phosphate-citrate à différents pH. Deux
tampons sont préparés : 1) un tampon Na2HPO4 à 0,05 M, EDTA 0,5 mM et DTT 0,5 mM, 2)
un tampon citrate à 0,05 M, EDTA 0,5 mM et DTT 0,5 mM. Les deux tampons sont mélangés
jusqu’à atteindre le pH souhaité. Une solution de BSA à 1 g.L -1 est préparée, ainsi qu’une
solution de PLP à 1 mM et une solution d’ornithine à 20 g.L -1 . Dans un volume réactionnel de
5 mL (un volume réactionnel de 2 mL est nécessaire, sachant que 1 mL d’échantillon sera
dérivé pour l’analyse HPLC) sont ajoutés : 25 mg.L -1 de BSA, 0,5 µM de PLP, l’enzyme
purifiée et le tampon phosphate-citrate qsp 5 mL (sans l’ornithine). Le mélange réactionnel
est incubé 1h à 35°C (température optimale de l’enzyme) afin que l’enzyme se stabilise dans
sa conformation active. L’ornithine est ensuite ajoutée de 0,1 mM à 5 mM pour tester
différentes concentrations en substrat. 1 mL de volume réactionnel est prélevé à 15 min, 30
min, 45 min et 60 min. La réaction enzymatique est arrêtée en ajoutant 1,75 mL de tampon
borate 1M, pH 9, et 750 µL de méthanol (dans un vial de 4 mL à bouchon à vis). Tous les
prélèvements sont dérivés en même temps en ajoutant 40 µL de standard interne et 30 µL de
réactif de dérivation DEEMM (diéthyl éthoxyméthylènemalonate). Les échantillons sont
traités 30 min dans un bain à ultra sons puis 1h30 à 2h à 70°C avant d’être analysés en HPLC
pour la quantification de putrescine (Cf. protocole de dérivation HPLC chapitre X A).
86