THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Sommaire
VI. Clonages ..................................................................................................................... 72
A. Construction des vecteurs pGID052-hdcAB et pGID052-hdcPAB .......................... 73
1) Construction du vecteur pGID052-hdcAB ............................................................. 73
2) Construction du vecteur pGID052-hdcPAB .......................................................... 73
B. Construction du vecteur pGID052-odcpotE .............................................................. 74
C. Construction des vecteurs pDL-hdcP et pDL-hdcAB ................................................ 75
D. Construction du vecteur pXT-hisRS .......................................................................... 76
E. Intégration du pDL-hdcP et pDL-hdcAB dans le génome de Bacillus subtilis 168 .. 76
F. Intégration du pXT-hisRS dans le génome de Bacillus subtilis 168 et dans B. subtilis
168 contenant le pDL-hdcP ............................................................................................... 77
G. Construction d’un vecteur suicide pour la mutation du gène odc .............................. 78
VII. Vérification des transformants ................................................................................... 78
A. Par PCR sur colonie ................................................................................................... 78
B. Par PCR puis séquençage ........................................................................................... 78
VIII. Test et mesure de l’activité des promoteurs ............................................................... 78
A. Sur milieu gélosé ........................................................................................................ 78
B. Mesure de l’activité β-galactosidase .......................................................................... 79
IX. Induction de l’expression de hisRS cloné dans le pXT ............................................. 79
X. Dosage des amines biogènes et acides aminés par HPLC. ............................................ 80
A. Dérivation au DEEMM .............................................................................................. 80
B. Analyse HPLC ........................................................................................................... 80
XI. Analyses HPLC MS/MS ............................................................................................ 81
Chapitre II ................................................................................................................................. 84
I. Purification de l’ornithine décarboxylase de O. oeni .................................................... 84
A. Gel SDS-PAGE .......................................................................................................... 85
B. Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976) ......................................... 86
II. Mesure de l’activité enzymatique de l’ornithine décarboxylase ................................... 86
Chapitre III ............................................................................................................................... 87
La PCR quantitative en temps réel ........................................................................................ 87
A. Définition ................................................................................................................... 87
B. Calcul de l’expression relative des transcrits ............................................................. 88
C. Protocole RT-qPCR ................................................................................................... 89
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