THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Matériels et méthodes
prélevée délicatement (sans toucher les bords du tube), puis transvasée dans un nouveau tube.
Pour éliminer les traces de phénol, deux lavages au chloroforme/IAA (alcool isoamylique)
sont effectués volume à volume : autrement dit 600 µL de chloroforme/ IAA sont ajoutés aux
600 µL contenant l’ADN à extraire. La partie supérieure est prélevée et l’ADN est précipité
avec 600 µL d’isopropanol froid. Après une centrifugation à 4°C de 20 min à 15000 g, le
culot d’ADN est lavé à l’éthanol 70% (200 µL). Le culot est séché à l’air après une
centrifugation de 10 min à 15000 g, toujours à 4°C. Enfin, l’ADN est repris dans 50 µL d’eau
MilliQ stérile. La concentration d’ADN est déterminée par mesure de la DO à 260nm
(1UDO260nm = 50µg.mL -1 ADN)
IV. Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)
La PCR permet d’amplifier spécifiquement un fragment d’ADN situé entre deux
amorces nucléotidiques, encore appelées oligonucléotides, composées d’une vingtaine de
paires de bases. Afin d’optimiser la réaction de PCR, les amorces doivent être spécifiques de
la région à amplifier. De plus, elles ne doivent pas s’hybrider entre elles ou sur elles mêmes et
ne pas former de structure secondaire. Les amplifications sont réalisées à l’aide d’un
thermocycleur (BioRad) et d’une enzyme thermostable, la Taq polymérase (Promega) ou une
Taq haute fidélité (Roche) selon les instructions du fournisseur. La Taq haute fidélité est
réservée à l’amplification des fragments d’ADN destinés à être séquencés ou à être cloné en
vue d’une expression de gène in vivo.
A. Amplification avec la Taq Promega
Chaque réaction avec la Taq (Promega) est réalisée dans un volume final de 25 µL
contenant l’ADN matrice (10-100 ng), les désoxyribonucléotides (200 µM de chaque dNTP),
les deux amorces (1 µM de chaque), du MgCl2 (1,5 mM) et la Taq polymérase (0,5 U). Le
programme d’amplification comprend : une étape de dénaturation de 5 min à 94°C, suivie de
30 cycles de trois étapes : i) dénaturation de l’ADN pendant 30 s à 94°C, ii) hybridation
pendant 50 s à une température de 5 °C inférieures à la température de fusion des amorces
(Tm signifiant « temperature melting »), iii) élongation à 72°C. Le temps d’élongation dépend
de la longueur du fragment à amplifier et de la Taq employée : pour la Taq Proméga une
minute est nécessaire par kb amplifié, pour la Taq Roche 0,6 min/kb. Le cycle se termine par
une élongation finale de 2 min à 72°C. Environ 1/10 ème des produits d’amplification, soit 5 à
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