THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Matériels et méthodes
un substrat de la β-galactosidase. La coloration bleue des colonies témoigne de la dégradation
du X-gal par la β-galactosidase, donc de l’activité du promoteur.
B. Mesure de l’activité β-galactosidase
La mesure de l’activité β-galactosidase repose sur l’utilisation d’un substrat
synthétique, l’ONPG (Ortho Nitro Phényl Galactopyranoside) dont l’hydrolyse par la β-
galactosidase libère de l’ONP (Ortho Nitro Phényl) absorbant à 420 nm. L’activité
enzymatique exprimée en U Miller est déterminée par mesure de la variation de DO420nm en
fonction du temps. Afin de comparer l’activité (A) des différents extraits cellulaires, la
concentration protéique de ces extraits est mesurée par la méthode de Bradford (BioRad) et
l’activité spécifique (AS) des échantillons est calculée.
Des prélèvements de 50 mL de culture à partir de DO600nm = 0,5 sont centrifugés puis
resuspendus dans 700 µL de tampon Z (Na2HPO4 [0,06 M], NaH2PO4 [0,04 M], KCl [0,01
M], MgSO4 [0,001 M], β-mercaptoéthanol [100 mM]). Les cellules sont cassées à l’aide d’un
Fastprep (2 cycles de 30 secondes à puissance 6) en présence de 0,4 mg de billes de verre (70
à 100 µm de diamètre). Cent µL d’extrait cellulaire sont ajoutés à 700 µL de tampon Z et
préchauffés à 65 °C. La réaction enzymatique est déclenchée par ajout de 200 µL d’ONPG (4
mg.mL -1 ). La réaction est arrêtée par ajout de 500 µL de Na2CO3 (1 M). Le temps de réaction
est chronométré puis l’absorbance est lue à DO420nm. L’activité enzymatique est calculée selon
l’équation suivante :
A= (1,5 x 1000 x DO420nm) / (t x v) en unités de β-galactosidase. mL -1
t : temps de réaction en min, v : volume d’extrait bactérien en mL
L’activité spécifique AS= A/ [protéines] Umiller.mg -1
IX. Induction de l’expression de hisRS cloné dans le pXT
Les souches de B. subtilis 168 recombinées avec le vecteur pXT-hisRS sont
ensemencées en milieu LB en présence de 100 µg.mL -1 de spectinomycine à DO600nm = 0,05.
A DO600nm = 0,7 ; 20 mM de xylose (6 mL d’une solution de xylose à 1M) sont ajoutés pour
induire l’expression de hisRS. Après induction, 50 mL de culture sont prélevés toutes les
demi-heures, pendant environ 3h, et centrifugées pendant 10 min à 2000 g. Les culots sont
stockés à -20°C avant de de doser l’activité β-galactosidase.
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