THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Matériels et méthodes
sur la colonne, le débit est réglé à 0,5 mL.min -1 . La colonne est lavée avec 20 mL de tampon
NaH2PO4 (au moins 10 volumes de colonne) contenant 20 mM d’imidazole (le débit peut être
augmenté à 1 mL.min -1 ). L’enzyme est éluée par palier en augmentant la concentration en
imidazole, de 50 mM à 150 mM. On obtient ainsi différentes fractions d’élutions. Elles sont
ensuite déposées sur gel SDS-PAGE pour évaluer leur pureté. Les fractions contenant
l’enzyme sont regroupées et un dosage de Bradford est effectué pour déterminer la
concentration protéique de l’extrait purifié. L’enzyme est conservée en solution glycérol 30%
à -20°C en fractions aliquotes de 500 µL.
A. Gel SDS-PAGE
Préparation du gel de séparation à 10% d’acrylamide
Pour 10 mL (nécessaire à la préparation de 2 gels de 8,5 cm x 7 cm, les réactifs sont les
suivants : 4,1 mL d’eau MilliQ, 3,3 mL d’acrylamide/bis acrylamide 30:0,8 (40%, v/v)
(BioRad), 2,5 mL de tampon 4X, pH 8,8 (composé de 181, 71 g.L -1 de Tris-HCl), 100 µL de
SDS 10%, 100 µL d’APS (persulfate d’ammonium) 10% et 4,5 µL de TEMED (N-N-N-
tétraméthyl éthylènediamine).
Préparation du gel de concentration à 10% d’acrylamide
Pour 5 mL (2 gels), sont mélangés : 3,6 mL d’eau MilliQ, 708 µL d’acrylamide /bis
acrylamide 30:0,8 (40%, v/v), 625 µL de tampon 8X, pH 6,8 (composé de 121,14 g.L -1 de
Tris-HCl), 50 µL de SDS 10%, 50 µL d’APS 10% et 5 µL de TEMED.
Dépôt des échantillons
10 µg de protéines additionnées de tampon de charge (1X final) sont déposés par puits, après
dénaturation des échantillons 5 min à 95°C. Le tampon de charge 4X est composé de : 3,2 mL
de SDS à 25%, 3,3 mL de glycérol à 100%, 0,8 mL de bleu de bromophénol à 0,5% (p/v), 200
µL de DTT à 100 mM et 2,5 mL de Tris 1M.
Migration des échantillons
Les échantillons migrent dans une cuve d’électrophorèse soumis à 200V pendant environ 1h,
dans du tampon d’électrophorèse 1X, préparé à partir de tampon 10 X constitué de : 30,2 g.L -1
de Tris base, 188 g.L -1 de glycine et 10 g.L -1 de SDS.
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