THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

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Sommaire VI. Clonages ..................................................................................................................... 72 A. Construction des vecteurs pGID052-hdcAB et pGID052-hdcPAB .......................... 73 1) Construction du vecteur pGID052-hdcAB ............................................................. 73 2) Construction du vecteur pGID052-hdcPAB .......................................................... 73 B. Construction du vecteur pGID052-odcpotE .............................................................. 74 C. Construction des vecteurs pDL-hdcP et pDL-hdcAB ................................................ 75 D. Construction du vecteur pXT-hisRS .......................................................................... 76 E. Intégration du pDL-hdcP et pDL-hdcAB dans le génome de Bacillus subtilis 168 .. 76 F. Intégration du pXT-hisRS dans le génome de Bacillus subtilis 168 et dans B. subtilis 168 contenant le pDL-hdcP ............................................................................................... 77 G. Construction d’un vecteur suicide pour la mutation du gène odc .............................. 78 VII. Vérification des transformants ................................................................................... 78 A. Par PCR sur colonie ................................................................................................... 78 B. Par PCR puis séquençage ........................................................................................... 78 VIII. Test et mesure de l’activité des promoteurs ............................................................... 78 A. Sur milieu gélosé ........................................................................................................ 78 B. Mesure de l’activité β-galactosidase .......................................................................... 79 IX. Induction de l’expression de hisRS cloné dans le pXT ............................................. 79 X. Dosage des amines biogènes et acides aminés par HPLC. ............................................ 80 A. Dérivation au DEEMM .............................................................................................. 80 B. Analyse HPLC ........................................................................................................... 80 XI. Analyses HPLC MS/MS ............................................................................................ 81 Chapitre II ................................................................................................................................. 84 I. Purification de l’ornithine décarboxylase de O. oeni .................................................... 84 A. Gel SDS-PAGE .......................................................................................................... 85 B. Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976) ......................................... 86 II. Mesure de l’activité enzymatique de l’ornithine décarboxylase ................................... 86 Chapitre III ............................................................................................................................... 87 La PCR quantitative en temps réel ........................................................................................ 87 A. Définition ................................................................................................................... 87 B. Calcul de l’expression relative des transcrits ............................................................. 88 C. Protocole RT-qPCR ................................................................................................... 89 6
Sommaire RESULTATS ............................................................................................................................ 91 I. Validation de la technique de transfert génétique par électroporation .......................... 91 II. L’histamine et la putrescine dans la résistance au stress acide chez O. oeni ................. 92 A. L’histamine dans la résistance au stress acide chez O. oeni ...................................... 93 1) Clonage de l’histidine décarboxylase hdcA et de la perméase associée hdcP de Lactobacillus hilgardii 0006 chez O. oeni ATCC BAA-1163. ..................................... 93 2) Etudes transcriptionnelles des régions promotrices de hdcA et hdcP de Lactobacillus hilgardii 0006 ......................................................................................... 95 3) Test de l’induction de l’activité β-galactosidase en présence d’acide aminé précurseur (histidine) ..................................................................................................... 96 4) Rôle de hisRS dans la voie de biosynthèse de l’histamine ..................................... 98 B. La putrescine dans la résistance au stress acide chez O. oeni .................................. 100 Article 1 .............................................................................................................................. 104 Article 2 .............................................................................................................................. 123 DISCUSSION-PERSPECTIVES ........................................................................................... 142 Partie I ................................................................................................................................. 142 Partie II ................................................................................................................................ 143 Partie III .............................................................................................................................. 145 ANNEXES .............................................................................................................................. 147 REFERENCES ....................................................................................................................... 162 RESUME ................................................................................................................................ 193 ABSTRACT ........................................................................................................................... 194 7
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ΔCT = CT (témoin interne) - CT (g
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Molecular cloning, heterologous exp
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W-X Références Wei M.Q., Rush C.M
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RESUME Résumé Les amines biogène
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