THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Discussion-Perspectives
décarboxylase de O. oeni a été produite chez E. coli, soulignant la nécessité d’avoir un
système d’expression puissant et performant.
Concernant l’expression de gènes des transporteurs d’acides organiques de O. oeni
chez E. coli, L. lactis ou encore L. plantarum, l’adressage, la conformation et l’insertion des
protéines à la membrane sont autant de barrières supplémentaires à l’expression hétérologue
de ces gènes. Au regard de tous ces essais, une tout autre approche est à envisager. Il s’agit de
muter ces gènes d’intérêt chez O. oeni. Des stratégies par simple et double recombinaisons
homologues ont été testées ou envisagées. Mais là encore nous sommes toujours confrontés
au problème de l’efficacité de transformation qui reste insuffisante. Il faut donc : soit trouver
un moyen d’augmenter le nombre de transformants, soit employer une autre technique de
transfert d’ADN, et pourquoi pas à l’aide de bactériophages ? Des souches lysogéniques de O.
oeni contenant des prophages, ont été isolées du vin (Arendt et al, 1991). Ainsi, il est donc
possible d’explorer cette voie pour transférer de l’ADN chez cette bactérie. Les
bactériophages ont déjà été utilisés en tant que vecteurs. Chez L. delbrueckii subsp.
bulgaricus, le phage mv4 s’intègre dans le chromosome, via une recombinaison entre sites
spécifiques (Dupont et al, 1994). Un vecteur a ensuite été construit contenant le site attP et
une intégrase du phage mv4, puis transféré chez L. plantarum, un hôte hétérologue. La
recombinaison s’effectue entre les sites attP et attB du génome bactérien, au gène codant le
tRNA Ser . L’étude du fonctionnement de l’intégration des phages chez O. oeni pourrait amener
à la construction de vecteurs intégratifs.
Partie II
La putrescine, issue en partie de la décarboxylation de l’ornithine, est l’amine biogène
majoritaire du vin. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre afin d’approfondir les
connaissances sur l’ornithine décarboxylase de O. oeni. Finalement, après les tentatives de
mutation et d’expression de cette enzyme chez O. oeni, la protéine a été caractérisée chez E.
coli, et les constantes cinétiques relatives à l’activité enzymatique ont été déterminées.
L’ODC de O. oeni BR14/97 est spécifique de la L-ornithine et ne peut pas décarboxyler la L-
lysine en cadavérine. De plus, le séquençage de cinq gènes odc, issus de souches isolées de
vin et de cidre à travers le monde, a été obtenu. Les différences inter-séquences concernent
uniquement les souches provenant du cidre, et impliquent les acides aminés en position : 31,
448 et 620. L’histidine 31 est remplacée par l’arginine. La valine 448 est remplacée par
l’isoleucine (un carbone supplémentaire) à chaine latérale apolaire. Enfin l’acide aspartique
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