THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Matériels et méthodes
avec le kit Gel Purification (Sigma). Le vecteur pGID052 a été digéré par les enzymes SalI et
SacI puis purifié à l’aide du kit PCR Clean up (Sigma). La réaction de ligation s’est ensuite
effectuée en présence des trois partenaires : le vecteur et les deux fragments à cloner pendant
24h à 16°C. Après dialyse sur un filtre de 0,025 µm (Whatman), 1/5 de la réaction de ligation,
soit 4 µL ont été utilisés pour transformer E. coli EC101. Les cellules électroporées (environ
1,1 mL de volume final) sont étalées sur milieu LB agar contenant 250 µg.mL -1
d’érythromycine. Le vecteur obtenu est appelé pGID052-hdcPAB.
Figure 17. Stratégie de clonage des gènes hdcP, hdcA et hdcB. Les fragments A et B sont
d’abord sous-clonés dans le pCR-XL-TOPO, avant d’être clonés dans le pGID052.
B. Construction du vecteur pGID052-odcpotE
Le vecteur pGID052-odcpotE contient les gènes odc et potE de O. oeni BR14/97,
impliqué dans la production de putrescine. Il a été obtenu suivant une stratégie similaire à la
construction du vecteur pGID052-hdcPAB. Le fragment odc-potE de 4160 pb de O. oeni
BR14/97 a été cloné en deux parties (Figure 18). Tout d’abord un premier fragment A de
1829 pb correspondant à la région 5’ du gène odc, et un second fragment B de 2352 pb
correspondant à la région 3’ du gène odc et au gène potE ont été clonés dans le pCR-XL-
TOPO (Invitrogen). Les amorces ODC1 et ODC3 ont servi à l’amplification du premier
fragment (A), tandis que le second fragment (B) à été amplifié en utilisant le couple POTE1 et
POTE2. Les amorces ODC3 et POTE1 possèdent le site de restriction PstI présent dans le
gène odc. Les clones recombinants ont été nommés pTOPO-odc et pTOPO-potE. Le premier
a été digéré par BamHI et PstI et le second par PstI et SacI, afin de récupérer les fragments
pour le clonage dans le vecteur d’intérêt. Le pGID052 digéré par BamHI et SacI a servi à la
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