THESE Maryse Bonnin Jusserand - Université de Bourgogne

Matériels et méthodes
fluorescence est significativement différente du bruit de fond. Ce CT est inversement
proportionnel au nombre initial de copies de matrice. Plus la quantité de matrice est grande,
plus le CT est petit. L’agent fluorescent utilisé au laboratoire est le SYBR Green (BioRad) qui
s’intercale dans l’ADN double brin. La mesure de la fluorescence est réalisée à chaque fin
d’élongation du cycle PCR, afin de quantifier l’ADN nouvellement synthétisé (Figure 22).
B. Calcul de l’expression relative des transcrits
Pour l’exactitude des calculs, il est nécessaire de :
i) Choisir des amorces spécifiques de la matrice (la formation de dimères d’amorces ou de
structures secondaires émet de la fluorescence parasite, ce qui fausse la quantification).
Les amorces sont sélectionnées dans la partie transcrite du gène, de préférence à proximité de
la partie 5’ car certains ARNm sont instables et ont tendance à se dégrader par la partie 3’. La
taille de l’amplicon doit être comprise entre 80 et 120 pb. Ces amorces doivent comprendre
environ 20 paires de bases, avec un pourcentage en bases G et C proche de 50%, et une base
G ou C à l’extrémité 3’. Leurs températures de fusion doivent de préférence être supérieures à
60°C.
ii) Avoir une efficacité de PCR proche de 100%
Une efficacité de 100% correspond à un doublement du nombre de copies d’ADN à chaque
cycle. Si la valeur de l’efficacité est en-dessous de 85% ou au-dessus de 115%, il faut définir
de nouvelles amorces.
iii) Définir de bons témoins internes
Le taux de transcrit d’un gène doit être normalisé par un étalon (ou témoin interne). La
quantité de messagers de cet étalon doit être stable au cours des conditions expérimentales
testées. Pour chaque expérience, il est nécessaire de vérifier le niveau d’expression du gène
référant choisi.
La méthode de calcul est basée sur la comparaison des seuils critiques dite des 2 ΔΔCT. (Livak
& Schmittgen, 2001).
L’expression du gène d’intérêt est normalisée par rapport à celle du témoin interne :
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