PhylogÃ©nie Et Evolution Du Comportement Social Chez Les Blattes ...

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Ev o l u t i o n d u c o m p o r t e m e n t s o c i a lunités ribosomiques ont aussi été retenus.ǲǲ Obtention des caractères moléculairesJ’ai réalisé le séquençage moléculaire à la Brigham Young University de Provo (Utah,USA) dans le laboratoire du Dr Whiting. L’ADN des blattes et des termites a été extrait enutilisant le protocole Qiagen DNeasy pour tissus animaux. Les tissus musculaires thoraciquesdes termites et les tissus musculaires des pattes de blattes ont été utilisés. Les parties restantesdes individus ont été conservés et stockés dans de l’alcool 100% en tant qu’échantillons deréférence. ADN et échantillons de référence sont conservés dans le « Insect GenomicsCollection » de la Brigham Young University. Les détails du protocole d’extraction figurentdans l’Annexe II. Les différents marqueurs ont été amplifiés en un ou plusieurs fragmentsen fonction de la taille des séquences visées. Ainsi, les séquences de 12S rDNA (~ 360 pb), de16S rDNA (~ 385 pb), de cytochrome b (Cytb, 307 pb), et de cytochrome oxydase II (COII,incluant une portion de l’ARN de transfert codant pour la Leucine, ~ 725 pb) ont été amplifiésen un fragment, alors que les séquences de cytochrome oxydase I (COI, 1179 pb), de 18SrDNA (~ 1870 pb) et de 28S rDNA (~ 2200 pb) ont été séquencées en deux ou trois fragments(COI), et quatre fragments (18S et 28S). Divers protocoles d’amplification ont été utilisés etsont listés dans le Tableau II.2 avec l’ensemble des amorces utilisées. Le premier protocole aété appliqué pour tous les marqueurs sur les spécimens frais, alors que les protocoles suivantsétaient spécifiques à certains gènes et pour des taxons plus problématiques (e.g., spécimensplus anciens). Les PCR ont été réalisées à l’aide d’un thermocycleur Peltier (DNA EngineDYAD TM ). L’électrophorèse des produits PCR a été réalisée sur un gel d’agarose afin de vérifierla spécificité des produits amplifiés et d’inspecter les contaminations éventuelles à l’aide d’untémoin négatif.Les produits de PCR ont été purifiés à l’aide du kit « Montage PCR 96Cleanup »58
II. Mat é r i e l s e t m é t h o d e sTableau II.2 : Liste des différentes amorces et des protocoles utilisés. Les réactions de PCR pour lesquelles la température d’hybridationaugmente ont été réalisées par incrémentation de 0,2°C par cycle. Les régions COIa et COIbc ont été obtenues avec les couples d’amorces LCO/ HCO et mtd6 / Calvin, respectivement. BYU = Brigham Young University.Gènes Amorces Séquences (5’-3’) Sources12Sai AAA CTA GGA TTA GAT ACC CTA TTA T Simon et al., 199412S12Sbi AAG AGC GAC GGG CGA TGT GTSimon et al., 199416SCytbCOIICOI18S28S16SAr16SFcytb612cytb920FleuRlysLCOHCOmtd6calvinRonDeep6R2Deep6f21F1.2Fb5.02Fb2.9a1.07Ra3.59RRd1.2aRd3bRd3.2aRd4bRd4.2b28SA28SBRd4.5aRd7.b1CGC CTG TTT ATC AAA AAC ATTTA CGC TGT TAT CCC TAACCA TCC AAC ATC TCC GCA TGA TGA AACCC TCA GAA TGA TAT TTG GCC TCATCT AAT ATG GCA GAT TAG TGCGAG ACC AGT ACT TGC TTT CAG TCA TCGGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG GTAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CAGGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CCGGR AAR AAW GTT AAR TTW ACT CCGGA TCA CCT GAT ATA GCA TT CCCWCC WAC DGT RAA YAT RTG RTG DGCTTG AYC CWG CWG GDG GDG GNG AYC CTAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT AGTGC TTG TCT CAA AGA TTA AGCTAA CCG CAA CAA CTT TAA TAGG GTT CGA TTC CGG AGA GGG AGCTAT CTG ATC GCC TTC GAA CCT CTGGT GAA ATT CTT GGA CCG TCGCA TCA CAG ACC TGT TAT TGCTTG TGC ATG GCC GYT CTT AGTGAT CCT TCC GCA GGT TCA CCT ACCCC SSG TAA TTT AAG CAT ATT ACCY TGA ACG GTT TCA CGT ACTAGT ACG TGA AAC CGT TCA SGG GTCCT TGG TCC GTG TTT CAA GACCCT TGG TCC GTG TTT CAA GAC GGGAC CCG TCT TGA AGC ACGTCG GAA GGA ACC AGC TACAAG TTT CCC TCA GGA TAG CTGGAC TTC CCT TAC CTA CATXiong and Kocher, 1991Kambhampati 1995Kocher et al., 1989Kocher et al., 1989Whiting, 2002aWhiting, 2002aFolmer et al., 1994Folmer et al., 1994Simon et al., 1994Whiting lab, BYUSimon et al., 1994Whiting lab, BYUWhiting lab, BYUGiribet et al., 1996Whiting, 2002aWhiting et al., 1997Hillis and Dixon, 1991Jarvis et al., 2004Whiting et al., 1997Whiting, 2002aWhiting, 2002aGiribet et al., 1996Whiting, 2002aJarvis et al., 2004Whiting, 2002aJarvis et al., 2004Whiting, 2002aWhiting et al., 1997Whiting et al., 1997Whiting, 2002aWhiting, 2002aGène Chauffage Dénaturation Hybridation ExtensionExtensionfinaleTous 94°C (2min) 94°C (1min) 55°C (1min) 72°C (1min 15s) 72°C (7min) 40Cytb 94°C (2min) 94°C (1min) 51.5 to 59.5°C (1min) 72°C (1min 15s) 72°C (7min) 4016S 94°C (2min) 94°C (1min) 50°C (1min) 72°C (1min 15s) 72°C (7min) 40COII 94°C (2min) 94°C (1min) 45 to 53°C (1min) 72°C (1min 15s) 72°C (7min) 40COIa 94°C (2min) 94°C (1min) 49.5 to 57.5°C (1min) 72°C (1min 15s) 72°C (7min) 40COIbc 94°C (2min) 94°C (1min) 50°C (1min) 72°C (1min 15s) 72°C (7min) 4028SB 94°C (2min) 94°C (1min) 50°C (1min) 72°C (1min 15s) 72°C (7min) 40Cycles59
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