Immunhistologische Charakterisierung primärer Neoplasien des ...

Material und Methoden
Als Sekundärantikörper wurde biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-Ig und Ziege-anti-
Maus-Ig Hyperimmunserum (Firma Vektor Laboratories; Peterborough, England)
1:200 in PBS verdünnt. Der Pferde-anti-Maus-Ig Sekundärantikörper von der Firma
Vektor Laboratories (Peterborough, England) wurde 1:110 in PBS verdünnt verwendet.
Der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Vectastain Elite ABC-Kit, Fa. Vector Laboratories,
Peterborough, England) diente als Detektionssystem. Die Vorbehandlungen
sind ausführlich im Anhang 9.4 beschrieben.
3.7.2 Durchführung der immunhistologischen Untersuchung (ABC-
Methode)
Der immunhistologische Nachweis der Antigene erfolgte nach der von HSU, RAINE
und FANGER (1981) beschriebenen und von WÜNSCHMANN et al. (1997) modifizierten
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Methode.
Die Inkubationen der Antikörper und des Detektionssystems wurden, soweit nicht
anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt. Zum Auftragen der Antikörper
und für die Waschschritte befanden sich die Objektträger in “Coverplates®“ (Thermo
Elektron Cooperation, Dreieich) und Sequenza®-Einsätzen (Thermo Elektron Cooperation,
Dreieich):
1. Entparaffinieren der Schnitte in Roti-Histol® zweimal für 5 Minuten, in Isopropylalkohol
einmal für 5 Minuten und in 96%-igem Alkohol einmal für 3 Minuten
2. Inaktivierung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml 85%-igem Ethanol und
3 ml frisch zugesetztem, 30%-igem H 2 O 2 für 30 Minuten unter Rühren
3. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten
4. Demaskierung in Abhängikeit des verwendeten Antikörpers (siehe Tab. 3.2)
5. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten
6. Verbringen der Schnitte in “Coverplates®“
7. Inkubation der Schnitte mit dem jeweiligen Blocking-Serum (siehe Tab. 3.2) für
30 Minuten
8. Auftragen des primären Antikörpers und Inkubation über Nacht bei 4°C im
Kühlschrank
9. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten
10. Auftragen des sekundären Antikörpers und Inkubation für 30 Minuten (siehe
Tab. 3.2)
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