Immunhistologische Charakterisierung primärer Neoplasien des ...

Material und Methoden
11. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten
12. Inkubation der Schnitte mit dem ABC- Komplex für 30 Minuten
13. Dreimaliges Waschen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten
14. Auftauen des DAB (3,3`-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid) “stock solution a-
liquot“ (100 mg DAB in 50 ml PBS auflösen, bei –20°C einfrieren) in Dunkelheit,
mit 150 ml PBS verdünnen und durch zwei unsterile Faltfilter (Fa. Sartorius
AG; Göttingen) laufen lassen; dann 3 ml 3%iges H 2 O 2 zur DAB-Lösung hinzugeben
und Schnitte unter Rühren für 10 Min. bei Zimmer-temperatur inkubieren
15. Waschen der Schnitte für 5 Minuten in PBS
16. Waschen der Schnitte mit laufendem Leitungswasser für 10 Minuten
17. Gegenfärbung der Schnitte in Mayer´s Hämatoxylin- Lösung
(1:20 verdünnt in Aqua bidest.) für 10-60 Sekunden; Bläuen der Schnitte für 10
Minuten in Leitungswasser; Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe
für je 3 Minuten in 50-,70-, 96%-igem Alkohol, für 3 Minuten in
100%igem Isopropylalkohol und für zweimal 5 Minuten in Essigsäurebutylester
(EBE; Fa. Roth, Karlsruhe) als Intermedium
18. Maschinelles Eindecken der Schnitte mit dem Eindeckungsfilm Histokit® (Fa.
Roth, Karlsruhe) im Eindeckautomaten RC M 2000 (Medite Medizintechnik,
Burgdorf)
3.7.3 Kontrollen
Als Negativkontrollen wurden anstatt des Primärantikörpers die in der Tab. 3.3 aufgelisteten
Seren aufgetragen. Als Kontrollserum für die polyklonalen Antikörper diente
Serum aus dem Blut gesunder Kaninchen in PBS verdünnt, das nach 2-4 stündigem
Stehen bei Raumtemperatur durch Zenfrifugation für 10 Minuten bei 370 x g
gewonnen und bei -20°C gelagert wurde. Für die monoklonalen Antikörper diente
Aszitesflüssigkeit von Balb/cJ- Mäusen in PBS verdünnt (Fa. Biologo, Kronshagen)
oder Gewebekulturüberstand als Negativkontrolle. Die Positivkontrollen sind detailliert
im Anhang 9.2.1 dargestellt.
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