Immobilisierung

Experimentelle Durchführung
6.4 Elektrochemische Messungen
6.4.1 Vorbereitung der Elektroden; polieren und elektrochemisches Reinigen
Zuerst wurden die Goldelektroden mit drei verschiedenen Diamantsuspensionen poliert.
Die Korngrößen der Diamantkörner waren 3 µm, 1 µm und 0.5 µm. Jede Elektrode wurde mit
jeder Korngröße fünf Minuten poliert. Anschließend wurde die Elektrode in einer eins zu eins
Lösung aus Wasser und Ethanol zehn Minuten im Ultraschallbad behandelt. Die vorbehandelte
Elektrode wurde elektrochemisch in 2 M Schwefelsäure weiter gereinigt. Dabei wurden
jeweils 20 Zyklen von -0.2 mV bis 1.75 mV gefahren. Die Spannungsvorschubsgeschwindigkeit
betrug 0.1 mV/s. danach wurde die Elektrode mit dest. Wasser gespült und in 0.1 M PB,
pH 7.5, gelagert.
6.4.2 Messung von k 2 und K M
Die Messungen zu dem K M – und k 2 Wert erfolgten nach der folgenden allgemeinen
Durchführung.
Im zweiten Schritt wurde eine Stammlösung von Ferrocenmethanol, Konzentration
0.5 mM, in PB 0.1 M, pH 7.5,hergestellt. Das Ferrocenmethanol wurde im Ultraschallbad bei
ca. 4°C gelöst.
Im dritten Schritt wird die genaue Konzentration des Enzyms durch UV/VIS Spektroskopie
bestimmt. Dafür wird erst mit der Ferrocenmethanolstammlösung der Hintergrund bestimmt
und dann das Enzym (1-2 µl) zugegeben. Von dieser konzentrierten Lösung wird dann
auf 2.15 ml und eine Enzymkonzentration von 0.2 µM, 0.1 M PB, pH 7.5, 0.5 mM Ferrocenmethanol,verdünnt.
Von dieser Messlösung werden dann 150 ml abgenommen und das Substrat
darin gelöst. Es wird so viel NADPH gelöst damit eine Endkonzentration von 3 mM erreicht
wird, wenn das gesamte Volumen von 150 ml ausgetauscht wurde.
Vor jeder Messung wird die Lösung 20 s gerührt und danach 7 s ruhen gelassen. Die Messungen
wurden in einem Drei-Elektroden-Aufbau durchgeführt mit der vorher gereinigten
Goldarbeitselektrode, einem frisch erhitzen Platindraht als Gegenelektrode und einer
Ag/AgCl – Referenzelektrode. Zuerst wird eine Leermessung bei 5 mV/s in der Enzym-
Ferrocenmethanolstammlösung von (-0.1 mV - 0.35 mV) vs Ag/AgCl durchgeführt. Diese
Einstellungen werden für alle weiteren Messungen beibehalten. Für die weiteren Messungen
wurde zuerst das Volumen an Lösung entfernt, das danach von der Substratlösung hinzugege-
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