Immobilisierung

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Stand der Technik Bindung ist eine Diffusion wie bei dem ähnlichen Nickel-NTA-Histidin Komplexen nicht möglich. Deutlich effektiver und auch besser zu steuern ist die native chemische Ligation (NCL). Bei dieser Reaktion, die als Endprodukt eine Peptidbindung hat, reagieren ein Cystein und ein Thioester zusammen. Es ist kein Problem das Cysteinan der Oberfläche zu exponieren und daran das Enzym zu binden [66] . Auch kann die Vorbereitung des Thioesters durch EDC/NHS Chemie erfolgen und die Anbindung mit in situ mit SPR verfolgt werden, wie es von Meijer et.al demonstriert wurde [67] . Die Reaktion weist viele Vorteile auf, wie den selektiven und wechselseitigen Reaktionsverlauf, und die Orthogonalität zu anderen funktionellen Gruppen und Aminosäuren. Die Reaktion läuft im wässrigen Milieu ab und es entstehen keine Nebenprodukte. Die Amidbindung ist von Natur aus die Verbindugn zwischen zwei Aminosäuren und hat für die Anwendung mit biologischen Systemen eine herausragende Stabilität. Aufbauend auf der NCL ist die von Staudinger entwickelte Ligationsmethode. Dabei reagieren ein Thioester und ein Azid unter Abspaltung von Stickstoff als Koppelprodukt zu einem Iminophosphoranintermediat. Aus dieser Zwischenstufe kommt es über einen fünfgliedrigen Übergangszustand zur Ausbildung der Amidbindung unter Aufwendung von einem Molekül Wasser. Die Reaktivität unter den gegebenen milden Bedingungen gibt nahezu quantitative Ausbeuten, auch bei extrem geringen Enzymkonzentrationen. So konnte eine erfolgreiche Immobilisierung noch mit 50 µM Protein nachgewiesen werden [68] . Die letzte Methode zur Bindung von Enzymen an Oberflächen ist die Cycloaddition. Dabei gibt es zum einen die Variante der „Klick-Chemie“, die allerdings Kupfer als Katalysator benötigt. Dabei reagieren ein Akin und ein Azid zusammen zu einem Triazol, ohne das dabei Neben- oder Koppelprodukte anfallen. Ein breites Spektrum an Beispielen zur Immobilisierung verschiedener Proteine via kupferkatalysierter Klick-Chemie unter milden Bedingungen hat sich daraufhin entwickelt [69] . Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist der Erhalt der Stabilität der Proteine, die nach der Immobilisierung noch aktiv sind. Allerdings ist bei besonders empfindlichen Proteinen, genauso wie bei elektrochemischen Experimenten Vorsicht angebracht, da das Kupfer den weiteren Verlauf durch Denaturierung oder störende Signale beeinflussen kann [70] . Eine Alternative dazu ist die Diels-Alder Cycloaddition. Die bereits beschriebene Maleimidoberfläche kann dabei wieder verwendet werden und fungiert als Dienophil, welches mit einem Peptid, das ein Dien trägt, reagieren kann [71] . Die weitere Reaktion läuft bei 10
Stand der Technik schwach sauren, wässrigen Bedingungen ab. Geschwindigkeit und Selektivität der Reaktion, die bei Raumtemperatur ablaufen kann, machen sie zu einem wertvollen Werkzeug bei der Herstellung von modifizierten Oberflächen. Waldmann et.al. nutzten die Diels-Alder Cycloaddition zur Immobilisierung von Enzymen, die die an ein Streptavidin banden. Dieses Streptavidin war mit einem Dien gekoppelt und wurde auf einer entsprechenden Maleimidoberfläche aufgetragen. Die Überprüfung der Ergebnisse erfolgt mit fluoreszenzmarkiertem Biotin [72] . 11
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