Immobilisierung

Experimentelle Durchführung
mosphäre gegeben. Durch diese Elektrolytlösung werden eine Goldelektrode (WE), eine Platinelektrode
(CE) und eine Ag/AgCl RE miteinander verbunden und eine wiederkehrende
Dreiecksspannung angelegt. Gemessen wurde so lange bis der maximale Strom nicht mehr
steigt, aber mindestens 200 Zyklen von -0.2 V vs Ag/AgCl bis -0.6 V vs Ag/AgCl mit einer
Spannungsvorschubsgeschwindigkeit von 200 mV/s.
6.4.5 Generelle Anbindung eines veränderten FNR Enzyms an ein Dendrimer
Eine Oberfläche, die mit einem Dendrimer beschichtet wurde, wird 20 Minuten mit einer
0.025 M NiSO 4 , 0.1 M KNO 3 und 0.05 M PB, pH 7.5, behandelt und danach dreimal mit
0.1 M PB, 0.1 M KNO 3 , pH 7.5, gespült. Über die mit Nickel beschichtete Oberfläche wird
eine 500 nM Enzymlösung, 0.1 M PB, pH 7.5, 0.1 M KNO 3 , gespült, bzw. gelagert. Der Anlagerung
des Enzyms kann mit SPR – Spektroskopie bzw. elektrochemisch gefolgt werden.
6.5 SPR Messungen
Die Experimente zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten werden mit einem Autolab
Twingle durchgeführt. Die goldbeschichteten Objektträger wurden von ssens bestellt und haben
den gleichen Brechungsindex wie das Prisma des Autolab Twingle. Alle weiteren Reagenzien
waren im Labor vorhanden, bzw. die Synthese des Ankers wurde in Kapitel 4.1.1.1
beschrieben.
6.5.1 FNR Anbindung an NTA – Liponsäureoberflächen
Die Oberfläche des Sensorchips wurde über Nacht mit einer methanolischen Lösung des
Liponsäure –NTA – Linkers (1 mg/ml) bedeckt. Der Chip wird anschließend mit Methanol
und Wasser abgespült und trocken geblasen. Der Chip wird in das SPR Spektrometer eingebaut
und die Oberfläche mit Laufpuffer gespült bis ein stabiles Signal gemessen wird. Danach
wird in der Software ein Assoziationsprogramm gestartet und die Zeiten für Assoziations- und
Dissoziationsphasen eingestellt. Nach Start der Methode wird die Oberfläche mit dem Laufpuffer
stabilisiert und eine 20 mM Nickelsulfatlösung für 15 Minuten über die Oberfläche
gespült, damit das Ankermolekül das Metall chelatisieren kann. Damit sind die Vorbereitungen
für das eigentliche Experiment abgeschlossen und die FNR kann für die eingestellte Zeit
über die Oberfläche mit dem komplexierten Metall gespült werden. Anschließend wird die
Dissoziation des Moleküls gemessen.
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