Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

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5.6 Untersuchungen im MRAS-System
Tabelle 5.12: Ergebnisse der MRAS Sekundärstrukturvorhersage für die miR-195 und miR-135 Bindestellen.
miR-135 miR-195 miR-135 miR-195
BS 1 BS 1 BS 2 BS 2
Anzahl analysierter Strukturen 50 110 110 50
Anzahl C ≠ U 21 76 24 11
C ≠ U in % 42 69 22 22
Für die 16 nt stromaufwärts vom SNP beginnende miR-195 Bindestelle 1 wurden in 69 %
aller verglichenen Sekundärstrukturen Unterschiede vorhergesagt. Die Struktur der zweiten
miR-195 Bindestelle, die etwa 400 nt stromabwärts vom SNP lokalisiert ist, wies Ungleichheit
in 22 % der analysierten Sekundärstrukturen auf. Es konnte ebenfalls ein Einfluss des SNPs
auf die Struktur der beiden miR-135 Bindestellen detektiert werden. Für die vorhergesagten
Sekundärstrukturen der MRAS 3’-UTR-Varianten wurden an der weiter vom SNP entfernten
miR-135 Bindestelle 1 in 42 % und an der miR-135 Bindestelle 2 in 22 % Unterschiede
beobachtet. In der Abb. 5.24 sind beispielhaft die für die beiden MRAS 3’-UTR-Varianten
vorhergesagten Sekundärstrukturen gezeigt. Diese verdeutlichen die mit dem SNP einhergehende
strukturellen Änderungen an der SNP-Position und der miR-195 Bindestelle 1.
MRAS C
U G A C
A
C
U
C
A
A
GU
C AA
A U A A A
A
G
C
UG
A A
C
G
G
C
C U U
U
C G G CAC
C C
A A A U
A
A
A A C
U
A
G
A
G U U U
U
C U G
C
G
C
G
U U G U G
A A G
C
C G
U
C
AU
G
C U U U GC
A
CU
G G
U U
C A
G G
C
1 7 6 0
1 7 7 0
1750
1780
C
C
1790
1740
1730
A
1800
1810
1740
miR-195 Bindestelle 1
MRAS U
U U
G
G
U
G U
C C
G U
U
C
CU
G
G A
UG
U A
U
CG
UG
A
C
AU
UA
AA
C C
C A C
U
U GA
C A C
UG
C C GU
G U
CA
U C
A A
CG U
G U GU
C U A
A G A
C
A
C
CU
C
U
AAU
U UU
G
G
G
GU
C UC
G
Abbildung 5.24: MRAS Strukturvorhersage weist auf SNP-induzierte Unterschiede hin. Beispielhafte
Darstellung des bei der mfold-Analyse beobachteten Einflusses des SNPs auf die Sekundärstruktur
der beiden MRAS-Varianten (C links und U rechts). Die Unterschiede betreffen nicht nur die Position
des SNPs (angedeutet durch Pfeile) sondern auch die miR-195 Bindestelle (grau hinterlegt).
C
1730
A
C
1750
U
U
1720
1 7 6 0
1710
1 7 7 0
1700
1780
1690
1790
U
5.6.4 Klonierung von MRAS Reportergen-Konstrukten
Für weiterführende Analysen im MRAS-System wurden Reportergen-Konstrukte generiert,
die die gesamte MRAS 3’-UTR Sequenz (C- bzw. U-Variante) in der MCS des pmirGLO
Dual Luciferase Reportervektors enthalten. Dazu wurden zunächst Primer, die an ihren Enden
die entsprechenden Restriktions-Schnittstellen enthalten und zudem geeignet sind, die
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