Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5.8 Untersuchungen im TCF21-System
Die Abb. 5.35 zeigt Beispiele der berechneten RNA-Sekundärstrukturen beider TCF21-
Varianten, die die diskutierten Strukturunterschiede verdeutlichen.
5.8.4 Klonierung von TCF21 Reportergen-Konstrukten
Für weiterführende in vitro Analysen im TCF21 rs12190287-System wurden pmirGLO Reportergen-Konstrukte,
die die gesamte TCF21 3’-UTR (C- bzw. G-Variante) enthalten, generiert.
Dazu wurden zunächst Primer ausgewählt, die an ihren Enden die erforderlichen
Restriktions-Schnittstellen aufweisen und die TCF21 3’-UTR-Sequenz flankieren (gemäß
NCBI Referenz-Sequenz NM_198392.2 19 ). Wie bereits im Zuge der Amplifikation der MRAS
3’-UTR konnte auch die TCF21 3’-UTR-Sequenz in ihrer Gesamtlänge nicht direkt mit den
gewählten Primern gewonnen werden. Daher wurden über zusätzliche Primer zunächst Teilfragmente
der TCF21 3’-UTR generiert. Deren Einsatz als Template ermöglichte die erfolgreiche
Generierung des vollständigen TCF21 3’-UTR Inserts (siehe Abb. 5.36).
cDNA Template
TCF21 Fragment 1
5'
3'
TCF21 FW 2-22
TCF21 Seq FW1
TCF21 3′-UTR
TCF21 RV 2030
TCF21 RV SalI
3'
5'
TCF21 Fragment 2
TCF21 3'-UTR-Insert
5'
3'
TCF21 FW DraI
5'
DraI
3'
3'
SalI
5'
TCF21 RV SalI
3'
SalI
5'
Abbildung 5.36: Generierung des Gesamtlänge TCF21 3’-UTR-Inserts über Teilfragmente. Die Amplifikation
der gesamten TCF21 3’-UTR war nur über die Teilfragmente 1 und 2 möglich.
Die umfangreiche vergleichende mfold-Analyse der TCF21-Varianten ergab klare strukturelle
Unterschiede. Die für die jeweilige Variante markanten Strukturelemente in der näheren
SNP-Umgebung waren bei der Faltung aller, einschließlich auch sehr kurzer RNA-
Abschnitte, beobachtbar. Dies lässt vermuten, dass auch kurze TCF21-Ausschnitte in der
Lage sind, derartig spezifische Strukturen auszubilden und sich somit in Bezug auf die strukturelle
Zugänglichkeit ähnlich zu entsprechend langen RNA-Abschnitten zu verhalten.
Zur Bestätigung dieser Annahme wurden zusätzliche TCF21 C- und G-Reporterplasmide
hergestellt, die nur einen 200 nt langen Ausschnitt der 3’-UTR enthalten. Als Template für die
Amplifikation der sogenannten „200er“ Inserts wurde Plasmid-DNA aus bestätigten Klonen
der 3’-UTR-Inserts eingesetzt (siehe Abb. 5.37).
19 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_198392.2
109