Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

3.9 Zellkulturmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.10 E.coli Stämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.11 Puffer und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4 Methoden 33
4.1 Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.1.1 Polymerase-Kettenreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.1.2 Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.1.3 Reverse Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.1.4 Klonierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.1.5 Herstellung elektrokompetenter E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.6 Kryokonservierung von E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2 Nukleinsäureanalytische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2.1 Konzentrationsbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2.2 Elektrophoretische Auftrennung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.2.3 Detektion von Nukleinsäuren im Gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.2.4 Isolation von Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.2.5 Restriktion von Plasmid-DNA und PCR-Produkten . . . . . . . . . . . 44
4.2.6 RNA-Isolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2.7 Fällung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2.8 Gelextraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.9 Aufreinigung von PCR-Produkten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.10 Einengen von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.11 Dephosphorylierung von Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.12 Radioaktive Endmarkierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.13 Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.2.14 in vitro Transkription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.2.15 RNA-Strukturprobing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.2.16 RNA-RNA-Annealing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.3 Zellbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.3.1 Kultivierung von Säugerzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.3.2 Kryokonservierung von Säugerzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.3.3 Transfektion von Säugerzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.3.4 Lyse von Säugerzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.3.5 Dual Luciferase-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.4 Computergestützte Methoden und Auswertungen . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.4.1 RNA-Strukturvorhersage mittels mfold . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.4.2 Online-Tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
4.4.3 Programme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
ii