Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
4.1 Molekularbiologische Methoden
4.1.1 Polymerase-Kettenreaktion
Im folgenden Abschnitt werden die in dieser Arbeit angewandten Methoden beschrieben,
bei denen eine Amplifikation nach dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase
chain reaction, PCR) erfolgte. Weitere detaillierte Angaben zu den verwendeten PCR-
Ansätzen und -Programmen sind im Anhang A.1 aufgeführt.
PCR zur Amplifikation von 3’-UTR Sequenzen
Zur Amplifikation der 3’-UTR Sequenz des jeweiligen Ziel-Gens wurde die cDNA-Bibliothek
von Clontech bzw. die mittels reverser Transkription aus zellulärer Gesamt-RNA gewonnene
cDNA als Template eingesetzt und die in Abschnitt 3.5.4 aufgeführten Primer verwendet.
Eine Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten Sequenzen einschließlich deren Ursprungs
sind in Abschnitt 4.1.4 aufgeführt. Zur Gewährleistung einer möglichst fehlerfreien Amplifikation
der Zielsequenzen wurden für diese PCRs High Fidelity DNA-Polymerasen verwendet
(Phusion ® , Precisor und Velocity) .
Mutagenese-PCR
Der Einzelbasenaustausch innerhalb einer Template DNA erfolgte mittels einer nach Picard
et al. [123] angelehnten Mutagenese-PCR unter Verwendung der Phusion ® High Fidelity
DNA-Polymerase. Das Prinzip ist in Abb. 4.1 schematisch dargestellt. Es wurden drei Primer
verwendet: FW, RV und Mutagenese (im Folgenden als M bezeichnet). Die FW- und
RV-Primer entsprechen den zur Amplifikation der 3’-UTR Sequenzen verwendeten Primern
(siehe 3.5.4). Der M-Primer wurde so gewählt, dass er Sequenz-komplementär zur SNP-
Region verläuft und zentral die einzufügende Base enthält. Die PCR selbst erfolgte in drei
separaten Amplifikationsschritten unter der Verwendung des in Tab. 4.1 aufgeführten PCR-
Programms. In der ersten PCR über zehn Zyklen (siehe Abb. 4.1 I) werden M- und RV-Primer
eingesetzt, um mit der Ausgangssequenz als Template einen Teil der mutierten Zielsequenz
zu amplifizieren. Anschließend wird der FW-Primer hinzugefügt und in weiteren zehn Zyklen
(siehe Abb. 4.1 II) das mutierte PCR-Fragment in seiner Gesamtlänge hergestellt. Nach
33