Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
MRAS 3’-UTR Sequenz zu flankieren, generiert (entsprechend der NCBI Referenz-Sequenz
NM_001085049.1 13 ). Da auch mittels verschiedener PCR-Variationen die 3’-UTR nicht als
gesamtes PCR-Fragment amplifiziert werden konnte, erfolgte zunächst die Amplifikation von
Teilfragmenten der MRAS 3’-UTR unter Verwendung zusätzlicher Primer. Das Einsetzen
dieser Fragmente als Template ermöglichte schließlich eine erfolgreiche Generierung des
kompletten MRAS 3’-UTR Inserts (siehe Abb. 5.25).
cDNA Template
MRAS 3′-UTR
5' 3'
MRAS FW XhoI
MRAS Seq RV
MRAS Fragment 1
5'
3'
XhoI
MRAS Seq FW1
3'
5'
MRAS RV SalI
MRAS Fragment 2
5'
3'
3'
SalI
5'
MRAS FW SacI
MRAS RV SalI
MRAS 3'-UTR-Insert
5'
SacI
3'
3'
SalI
5'
Abbildung 5.25: Generierung des Gesamtlänge MRAS 3’-UTR-Inserts über Teilfragmente. Die Amplifikation
der gesamten MRAS 3’-UTR-Sequenz war nur über die Teilfragmente 1 und 2 möglich.
5.6.5 Untersuchungen zur Rolle des SNPs auf die miRNA-vermittelte
Regulation von MRAS
Die Vorhersage der Sekundärstruktur der beiden MRAS-Varianten zeigte Unterschiede in
der lokalen RNA-Struktur in der Umgebung der miR-195 und miR-135 Bindestellen auf. Daher
wurde mittels Ko-Transfektions-Experimenten in HeLa-Zellen untersucht, ob diese Unterschiede
einen Einfluss auf die miRNA-vermittelte Regulation der MRAS 3’-UTR Varianten
haben.
Die in der Abb. 5.26 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die MRAS 3’-UTR U- in Relation
zur C-Variante jeweils von beiden miRNAs stärker gehemmt wird (94 vs. 86 und 90 vs.
75 % relative Luciferase-Aktivität). Weiterhin lassen die Daten erkennen, dass jeweils beide
MRAS-Varianten stärker durch die miR-135a herunterreguliert werden (94 vs. 90 bzw. 86
vs. 75 %). Diese Ergebnisse weisen somit darauf hin, dass die miRNA-vermittelte Regulation
von MRAS durch den SNP rs9818870 beeinflusst wird. Eine Ursache hierfür kann in einer
durch den SNP-induzierten Änderung der lokalen Sekundärstruktur liegen, die dazu führt,
dass beide MRAS-Varianten eine unterschiedliche Zugänglichkeit für miRNAs aufweisen.
Dies soll im Weiteren näher analysiert werden.
13 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001085049.1
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