Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4.2 Nukleinsäureanalytische Methoden
Die Inkubation erfolgte bei 37 °C über einen Zeitraum von 45 min. Der Reaktionsansatz wurde
auf eine Sephadex G50-Säule aufgetragen und die radioaktiv markierten Oligonukleotide
mit 400 µl H 2 O eluiert. Dies ermöglicht die Trennung des Eluats von den nicht eingebauten
Nukleotiden. Zur Überprüfung der Markierung wurde jeweils 1 µl Probe (= 1 fmol) mittels denaturierender
PAGE (siehe 4.2.2) aufgetrennt sowie eine Aktivitätsbestimmung (in cpm) von
jeweils 1 µl Probe in 3 ml Szintillationslösung durch Dreifachbestimmung am Wallac Counter
durchgeführt.
4.2.13 Hybridisierung
DNA-Annealing
Zur Klonierung der kurzen Reporter-Konstrukte (= nur miRNA Bindestelle) im AGTR1- bzw.
ESR1-System wurden die sense und antisense Stränge (siehe 3.5.1) zunächst hybridisiert.
Dazu wurden je 2 µl einer 1-µg/µl-Lösung der Einzelstränge mit 46 µl DNA Annealing-Puffer
gemischt, 3 min bei 90 °C denaturiert und anschließend 1 h bei 37 °C inkubiert. Eine Überprüfung
des Annealings erfolgte durch native PAGE (siehe 4.2.2).
RNA-Annealing
Zum Hybridisieren von siRNA bzw. miRNA guide und passenger Strängen wurden die jeweiligen
Einzelstränge äquimolar in RNA Annealing-Puffer gemischt, 3 min bei 95 °C erhitzt
und anschließend über einen Zeitraum von 2 h im Heizblock abgekühlt. Mittels nativer PAGE
(siehe 4.2.2) wurde die Bildung doppelsträngiger RNAs kontrolliert.
4.2.14 in vitro Transkription
Zur Herstellung von in vitro Transkripten wurde 800 bis 1000 ng linearisierte Plasmid-DNA
oder aufgereinigtes PCR-Produkt, das am 5’-Ende mit der T7 Promotor Erkennungssequenz
verlängert wurde, als Template eingesetzt. Die in vitro Transkription wurde unter Verwendung
des T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production Systems durchgeführt. Die reverse
Transkription erfolgte in Abhängigkeit der Transkriptlänge für 30 bis 60 min bei 37 °C. Nach
Zugabe von 1 u der im Kit enthaltenen DNase erfolgte eine weitere 15-minütige Inkubation
bei 37 °C. Danach wurde der Reaktionsansatz mit H 2 O auf 100 µl aufgefüllt und die RNA
mittels Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert (siehe 4.2.6). Zur Abtrennung der nicht eingebauten
Nukleotide wurde das Isolat mittels Sephadex G50 Säule gelfiltriert und das Eluat
EtOH-gefällt (siehe 4.2.7). Im Anschluss erfolgten die Resuspension der in vitro Transkripte
in H 2 O, deren photometrische Konzentrationsbestimmung (siehe 4.2.1) sowie eine Analyse
der Integrität mittels Agarose-Gelelektrophorese (siehe 4.2.2).
47