Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4.2 Nukleinsäureanalytische Methoden
vermengt, um die Nukleinsäuren mit Hilfe von UV-Licht detektieren zu können. Die Probenauftrennung
erfolgte je nach Gelgröße bei 60 bis 120 V für 20 bis 70 min unter Verwendung
von 1×TAE als Laufpuffer.
4.2.3 Detektion von Nukleinsäuren im Gel
SYBR Gold-Färbung
Für die Detektion von Nukleinsäuren im PAA-Gel kam der Fluoreszenz Farbstoff SYBR ® -
Gold zur Anwendung. Dieser interkaliert in einzel- und doppelsträngige Nukleinsäuren und
ermöglicht durch die Messung des Fluoreszenzsignals die Detektion von DNA und RNA.
Das PAA-Gel wurde für 10 min in einer 1:10.000 Verdünnung der SYBR ® Gold-Lösung in
1×TBE-Puffer geschwenkt, einmal mit H 2 O gewaschen und die Signale anschließend am
Typhoon-Scanner detektiert.
Ethidiumbromid-Färbung
Zur Detektion der Nukleinsäuren im Agarosegel erfolgte eine Zugabe von 1,5 µg/ml Ethidiumbromid
ins Gel. Die Banden wurden mittels UV-Licht visualisiert und fotografisch dokumentiert.
Autoradiographie
Der Einsatz von radioaktiv markierten Sonden ermöglicht eine Detektion der Signale mittels
sogenannter Storage Phosphor-Screens. Diese wandeln die beim radioaktiven Zerfall
entstehende ionisierende Strahlung in Signale um. Durch Laser-induzierte Anregung kommt
es zur Emission von Licht, dessen detektierte Signalstärke sich proportional zur Menge an
Radioaktivität in der Probe verhält. Die Screens wurden für 1 - 24 h Stunden auf die in
Polyethylen-Folie eingeschweißten bzw. getrockneten PAA-Gele aufgelegt und anschließend
am Typhoon-Scanner ausgelesen.
4.2.4 Isolation von Plasmid-DNA
Mini-Präparation
Zur Isolation von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab wurde eine 3 bis 5 ml ÜN-Kultur angesetzt.
Dazu wurde das LB-Medium entweder mit einem Bakterienkolonie-Abstrich oder
aber mit einer bereits vorhandenen Glycerinkultur angeimpft und für etwa 15 h schüttelnd
bei 37 °C inkubiert. Die Plasmid-Präparation erfolgte mit dem GenElute Kit nach Herstellerangaben.
Die Plasmid-DNA wurde mit 50 bis 100 µl Nuklease-freiem H 2 O eluiert und die
Konzentration, wie in Abschnitt 4.2.1 beschrieben, bestimmt.
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