Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
Der Gelausschnitt spiegelt die Spaltprodukte für die mRNA Positionen 1590-1635 wider.
Im Teil A der Abbildung sind die Pb 2+ -, im Teil C die RNase T1 -Spaltprodukte dargestellt.
Zur Orientierung ist im Abbildungsteil B die Sequenzier-Reaktion des AGTR1 A in vitro Transkripts
gezeigt. Ein Vergleich der Spaltprodukte beider AGTR1 in vitro Transkript-Varianten
(in linearer Form im Abbildungsteil D gezeigt) weist auf unterschiedliche Spaltprodukte in
der unmittelbaren Umgebung des SNPs hin. Das Pb 2+ -Spaltmuster zeigt deutliche Unterschiede
an den Positionen 1607/08 und 1621-1623. Die Position 1623 der A im Vergleich
zur C-Variante wird zunächst stärker hydrolysiert. Dann jedoch verringert sich mit steigender
Pb 2+ -Konzentration die Signalstärke sichtbar schneller. Eine mögliche Ursache hierfür
ist, dass die lokale Struktur der A Variante an der Position 1623 zugänglicher, das initiale
Spaltprodukt hingegen mit zunehmender Pb 2+ -Menge schneller einer weiteren Hydrolyse
ausgesetzt ist. Diese konzentrationsabhängige Abnahme ist auch für das Spaltprodukt an
der Position 1614 detektierbar. Darüber hinaus weist das AGTR1 C Transkript mehr Hydrolyseprodukte
und zusätzliche Spaltstellen auf, z.B. durch RNase T1 an der Position 1610
und durch Pb 2+ an den Positionen 1614-1622. Im Gegensatz dazu tritt für das A Transkript
eine Pb 2+ -bedingte Hydrolyse häufiger an der Position 1623 und eine RNase T1-bedingte
Spaltung an den Positionen 1616 und 1627 auf.
5.3.8 Kinetik der Bindung von miRNAs an AGTR1 RNA in vitro Transkripte
Zur weiteren Analyse der AGTR1-miR-155-Interaktion wurde die Kinetik der RNA-Wechselwirkungen
untersucht. Dazu wurden sogenannte Annealing-Versuche durchgeführt (siehe
4.2.16). Dabei wurden AGTR1 in vitro Transkripte und 32 P-markierte miR-155 bzw.
miR-155_SNP guide Stränge auf Komplexbildung hin analysiert. Zum Einlaufen in das Gel
sind die AGTR1 in vitro Transkripte mit einer Länge von etwa 900 Nukleotiden zu groß. Im
Falle einer Komplexbildung war daher eine Signal-Detektion in den Auftragstaschen der Gele
zu erwarten. Die miRNA guide Stränge bildeten jedoch bereits untereinander schwache
Komplexe in den Taschen der Gele (= Negativkontrolle ohne in vitro Transkript), der sich
durch Zugabe von in vitro Transkript nicht verstärkte. Es wurde zunächst davon ausgegangen,
dass die hohe Anzahl von Guaninen am 3’-Ende des miR-155 guide Stranges ursächlich
für die detektierten miRNA-miRNA Komplexe sind und dieser Sachverhalt zugleich die
Komplexbildung mit dem in vitro Transkript inhibiert. Diese Annahme konnte in Versuchen
mit miR-155 und miR-155_SNP guide Strängen, denen das 3’ Ende deletiert wurde (siehe
Tab. 3.6), nicht bestätigt werden. Auch die folgenden Änderungen der Versuchsbedingungen
ergaben keine detektierbaren Komplexe zwischen miRNA und in vitro Transkript: (1) Erhöhung
der Reaktions-Temperatur, (2) Testen unterschiedlicher Mg 2+ -Konzentration (0, 1 bzw.
10 mM Endkonzentration), (3) Erhöhung der in vitro Transkript-Menge (von 10- auf 20- bzw.
50-fachen Überschuss), (4) Keine Denaturierung der 32 P-markierten guide Stränge vor dem
Annealen (normal 2 min bei einer Temperatur von 95 °C), (5) Phenol-Chloroform-Extraktion
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