Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
AGTR1 3′-UTR
Pos. 1 - 886
2330
3215
5'
AUG
stop
rs5186
1 653 2309
2415
3273
3′
SV40 Poly A
MCS
5′-UTR CDS 3′-UTR
Abbildung 5.4: AGTR1 Luciferase-Reporter-Transkript der gesamten AGTR1 3’-UTR. Die 3’-UTR
Sequenz wurde in die MCS des pMIR-REPORT Vektors kloniert. Im Ergebnis entstanden die Varianten
A bzw. C des AGTR1 3’-UTRs des schematisch dargestellten Luciferase-Reporter-Transkripts.
5.3.4 Untersuchungen zur Rolle des SNPs auf die miRNA-vermittelte
Regulation von AGTR1
Zur weiteren Analyse des Einflusses des SNPs innerhalb der in der AGTR1 3’-UTR gelegenen
miR-155 Bindestelle auf die miRNA-vermittelte Regulation von AGTR1 wurden Zellkulturversuche
mit HeLa-Zellen durchgeführt. Diese exprimieren miR-155 nicht (http://www.
microrna.org). Eine Beeinflussung der Reportergen-Expression durch endogene miR-155
wird dadurch ausgeschlossen. Zunächst erfolgte die Ko-Transfektion der AGTR1 Reporter-
Plasmide (kurz A und C bzw. 3’-UTR A und C) mit der pre-miR-155, einem chemisch modifizierten,
partiellen Doppelstrang, dessen Sequenz und Modifikationen vom Hersteller Ambion
nicht angegeben werden.
Zunächst wurden Untersuchungen mit den kurzen AGTR1 Reporter-Konstrukten durchgeführt.
Dabei wurde für die kurzen AGTR1-Varianten eine annähernd vergleichbare Hemmung
der relativen firefly Luciferase-Aktivität beobachtet (siehe Abb. 5.5, 81 vs. 83 % Restaktivität).
Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu bereits publizierten Daten von Martin et al.
und Sethupathy et al. [146, 147], die eine differentielle Regulation der AGTR1-Varianten
durch die pre-miR-155 aufzeigten. Jedoch kamen in den beiden vorgenannten Studien anstatt
Minimal-Reportern Reporter-Konstrukte, die die gesamte AGTR1 3’-UTR Sequenz enthielten,
zum Einsatz. Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Ko-
Transfektionen von AGTR1 3’-UTR Reportern mit der pre-miR-155 sind im rechten Teil der
Abb. 5.5 dargestellt. Diese weisen untereinander eine deutlich differenzierte pre-miR-155
vermittelte Regulation auf (72 vs. 110 % relative Luciferase-Aktivität).
Die Ergebnisse im Hinblick auf die langen AGTR1-Reporter korrespondieren mit den bereits
publizierten Daten von [146, 147]. Eine vergleichende Betrachtung der Ergebnisse des
kurzen und langen AGTR1 A-Reporters zeigt jedoch, dass die Hemmung beider differenziert
ausfällt (81 vs. 72 % relative firefly Luciferase-Aktivität). Der Vergleich zwischen langem und
kurzem AGTR1 C Reporter weist ebenfalls eine deutliche Differenz der Reporteraktivität auf.
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