Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4.3 Zellbiologische Methoden
4.3.2 Kryokonservierung von Säugerzellen
Zur Kryokonservierung von Säugerzellen wurden Aliquots von etwa 10 6 Zellen in 1 ml Einfriermedium
(70 % Medium, 20 % FKS und 10 % DMSO) zunächst langsam bei -80 °C
tiefgefroren und nach zwei Tagen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt.
4.3.3 Transfektion von Säugerzellen
Die zu transfizierenden Zellen wurden am Vortag in Vollmedium ausgebracht und wiesen
zum Zeitpunkt der Transfektion eine 80-90 %-ige Konfluenz auf. Die Transfektions-Mixe
wurden in Opti-MEM ® angesetzt. Die Transfektion erfolgte durch Lipofektion. Dazu wurde
die Konzentration an Lipofectamine 2000 in Abhängigkeit der Menge und Konzentration
der zu transfizierenden Nukleinsäuren gemäß Herstellerangaben berechnet: für die
Plasmid-DNA wurde die 3-fache Menge und für die RNA 1 µg Lipofectamine 2000 pro
20 pmol RNA eingesetzt. Die entsprechende Menge an Lipofectamine 2000 wurde zunächst
für 5 min in Opti-MEM ® inkubiert und anschließend im Verhältnis 1:1 mit den ebenfalls
in Opti-MEM ® verdünnten, zu transfizierenden Nukleinsäuren durch Auf-und Abpipettieren
gemischt. Es erfolgte eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden
einmal mit PBS gewaschen und dann mit dem Nukleinsäure/Lipofectamine 2000-Gemisch
in Dreifach-Bestimmung transfiziert. Nach 4 h wurde der Transfektions-Mix abgenommen,
die Zellen einmal mit PBS gewaschen und Vollmedium hinzugegeben.
4.3.4 Lyse von Säugerzellen
Lyse für anschließende RNA-Extraktion
Die Zellen wurden 24 h nach Transfektion 1× mit PBS gewaschen, trypsiniert und in Vollmedium
aufgenommen. Es folgte eine Zentrifugation für 3 min bei 800×g, einmaliges Waschen
des Zellpellets mit PBS und eine erneute Zentrifugation. Das Zellpellet wurde dann in 200 µl
1% NP40 in PBS resuspendiert, 10 min bei 4 °C inkubiert und anschließend die RNA durch
Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert (siehe 4.2.6).
Lyse für anschließenden Luciferase-Assay
Für die Analyse der firefly und Renilla Luciferase-Aktivitäten mittels Dual-Luciferase-Assay
wurden die Zellen zunächst einmal mit PBS gewaschen. Die Lyse erfolgte dann in 1×PLB
(passive lysis buffer) auf einem Wipper für 30 min bei Raumtemperatur. Die Lysate wurden
bis zur Durchführung des Dual-Luciferase Assays (siehe 4.3.5) bei -80 °C gelagert.
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