Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...
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5.8 Untersuchungen im TCF21-System<br />
Zellen transfiziert. Anschließend erfolgte e<strong>in</strong>e Analyse der Hemmung der rekomb<strong>in</strong>anten<br />
TCF21-Transkripte sowohl auf mRNA-Ebene mittels qPCR als auch auf Prote<strong>in</strong>ebene durch<br />
Luciferase-Aktivitätsmessung.<br />
Vorarbeiten <strong>zu</strong>r Allel-spezifischen qPCR<br />
Die Analyse der Allel-spezifischen Hemmung der TCF21-Transkripte erforderte vorab das<br />
Generieren spezifischer RV-Primer. Diese sollten <strong>in</strong> der Lage se<strong>in</strong>, zwischen den beiden,<br />
sich nur <strong>in</strong> e<strong>in</strong>er Base unterscheidenden TCF21-Varianten <strong>zu</strong> diskrim<strong>in</strong>ieren. Das bedeutet,<br />
dass je e<strong>in</strong> Primerpaar die TCF21 C- bzw. TCF21 G-Sequenz amplifizieren soll. Da die<br />
entsprechenden <strong>Analysen</strong> mittels qPCR erfolgten, wurde e<strong>in</strong>e Amplikonlänge von 262 bp<br />
gewählt.<br />
Für beide PCRs wurde der TCF21 RT FW-Primer e<strong>in</strong>gesetzt. Die RV-Primer wurden <strong>zu</strong>nächst<br />
so gewählt, dass jeweils e<strong>in</strong>er komplementär <strong>zu</strong>m 3’-Ende der C-Variante bzw. <strong>zu</strong>m<br />
3’-Ende der G-Variante ist. Dem<strong>zu</strong>folge bildet der TCF21 RT RV C-Primer am 3’-Ende e<strong>in</strong>en<br />
mismatch <strong>zu</strong>m TCF21 G-Template, der TCF21 RT RV G-Primer am 3’-Ende e<strong>in</strong>en mismatch<br />
<strong>zu</strong>m TCF21 C-Template. Jedoch verursachte der E<strong>in</strong>satz beider RV-Primer e<strong>in</strong>e Amplifikation<br />
beider Templates. Auch mit Hilfe von Modifikationen ausgewählter PCR-Bed<strong>in</strong>gungen<br />
(u.a. Erhöhung der Anneal<strong>in</strong>g-Temperatur) ermöglichten diese Primer ke<strong>in</strong>e Allel-spezifische<br />
Amplifikation (Daten nicht gezeigt). Daher wurden neue RV-Primer mit e<strong>in</strong>em <strong>zu</strong>sätzlichen<br />
mismatch nahe des 3’-Endes generiert. Der Primer weist somit jeweils e<strong>in</strong>en mismatch <strong>zu</strong>m<br />
<strong>zu</strong> amplifizierenden Template, zwei mismatche <strong>zu</strong>m anderen Template auf (siehe Abb. 5.39).<br />
Dieser <strong>zu</strong>sätzlichen mismatch soll <strong>zu</strong> e<strong>in</strong>er Destabilisierung der B<strong>in</strong>dung <strong>zu</strong>m Template im<br />
3’-Bereich und somit <strong>zu</strong> e<strong>in</strong>er erhöhten Diskrim<strong>in</strong>ierungs-Wahrsche<strong>in</strong>lichkeit führen.<br />
5′ CTTCATCCACCTGTCTATTTGC 3′<br />
3′ GAGGTAGGTGGACAGATAAACG 5′<br />
5′ GTTCATCCACCTGTCTATTTGC 3′<br />
3′ GAGGTAGGTGGACAGATAAACG 5′<br />
5′ CTTCATCCACCTGTCTATTTGC 3′<br />
3′ CAGGTAGGTGGACAGATAAACG 5′<br />
5′ GTTCATCCACCTGTCTATTTGC 3′<br />
3′ CAGGTAGGTGGACAGATAAACG 5′<br />
TCF21 C<br />
TCF21 RT RV C MM20G<br />
TCF21 G<br />
TCF21 RT RV C MM20G<br />
TCF21 C<br />
TCF21 RT RV G MM20G<br />
TCF21 G<br />
TCF21 RT RV G MM20G<br />
Abbildung 5.39: Primer <strong>zu</strong>r Allel-spezifischen Amplifikation der TCF21-Varianten. Der TCF21 RT RV<br />
C MM20G-Primer dient <strong>zu</strong>r spezifischen Amplifikation des TCF21 C- während der TCF21 RT RV G<br />
MM20G-Primer nur die G-Variante amplifizieren soll. Rot umrandet s<strong>in</strong>d die mismatches zwischen<br />
dem TCF21 C- bzw. G-Template und dem entsprechenden Primer.<br />
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