Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
kung der Bindung zwischen miRNA und Ziel-RNA. Diese Veränderungen können aber dazu
führen, dass bei gleicher Zugänglichkeit der miRNA Bindestellen ein mismatch im seed
Bereich keinen messbaren Einfluss auf die Bindung zur SNP-Variante hat. Dieser Zusammenhang
stellt einen möglichen Erklärungsansatz für die ähnliche pre-miR-155-vermittelte
Repression beider kurzer AGTR1 Transkripte dar.
Ergänzend zur pre-miR-155 kamen zwei weitere miRNA-Tools mit bekannter Sequenz und
ohne chemische Modifikationen zur Anwendung (miR-155 und miR-155_SNP). Die Komplementaritäten
deren guide Stränge mit den AGTR1-Varianten sind der Abb. 5.2 dargestellt.
Die miR-155 ist durch eine Basenpaarung mit der AGTR1 A Variante an Position 5 ausgehend
vom 5’-Ende der miRNA gekennzeichnet. Das AGTR1 C weist jedoch an dieser
Position einen C-U mismatch auf. Durch Einführung eines U>G Basenaustausches innerhalb
des miR-155 guide Stranges an der Position 5 wird die miR-155_SNP generiert. Diese
bildet einen C-G match mit der AGTR1 C-Variante zugleich aber einen A-G mismatch mit
der AGTR1 A-Variante.
120
110
***
*
100
***
90
83 80
82
85
FL/RL in %
90
80
76
81
77
AGTR1 A
AGTR1 C
70
60
50
kurz
miR-155
3′-UTR
kurz
miR-155_SNP
3′-UTR
Abbildung 5.6: Hemmung der kurzen und langen AGTR1-Reporter durch die miR-155-Varianten.
HeLa-Zellen wurden im 24- (bzw. 96-) well Format mit je 100 (25) ng AGTR1 Reporterplasmid
(pMIR-Luci AGTR1 kurz A bzw. C oder pMIR-Luci AGTR1 3’-UTR A bzw. C) 1 (0,25) ng pRL-CMV
Plasmid-DNA und 0-150 nM 5 miR-155 oder miR-155_SNP ko-transfiziert. Nach 24 h wurden die
Zellen lysiert und anschließend die Luciferase-Aktivität gemessen. Die relativen firefly Luciferase-
Aktivitäten (FL/RL) wurden auf Ansätze ohne miRNA (nur Plasmid-DNA) normiert. Dargestellt sind die
Mittelwerte um Standardabweichungen von mindestens vier unabhängigen Experimenten.* p≤0.05,
*** p≤0.0001
Die Abb. 5.6 zeigt die Ergebnisse der Transfektionen aller AGTR1 Reporter-miRNA-Kombinationen.
Für beide Längen des AGTR1 A-Reporters führt die Ko-Transfektion der miR-155
5 Da nicht bei allen Experimenten eine Konzentrations-abhängige Hemmung zu beobachten war, ergeben sich
die Mittelwerte aus der jeweils stärksten Hemmung der relativen Luciferase-Aktivität und somit aus unterschiedlichen
Konzentrationen an miRNA.
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