Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

4 Methoden
Maxi-Präparation
Zur Isolation von Plasmid-DNA im großen Maßstab wurden zunächst 3 ml Kulturmedium
(LB-Medium, 100 µg/ml Ampicillin) mit einer Glycerinkultur angeimpft und diese Vorkultur
für 8 h bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Anschließend wurde diese 1:1.000 in 250 bis 300 ml
Kulturmedium verdünnt und für etwa 15 h über Nacht schüttelnd bei 37 °C inkubiert. Die
Plasmid-Präparation erfolgte unter Verwendung des NucleoBond ® Xtra Maxi Kits. Eine Resuspension
der Isopropanol-gefällten Plasmid-DNA (siehe 4.2.7) erfolgte mit 400 bis 600 µl
Nuklease-freiem H 2 O. Die Konzentration wurde gemäß Abschnitt 4.2.1 bestimmt.
4.2.5 Restriktion von Plasmid-DNA und PCR-Produkten
Die Restriktion von Plasmid-DNA bzw. PCR-Produkten erfolgte je nach verwendetem Enzym
in dem vom Hersteller angegebenen Puffer bei 37 °C für 30 bis 120 min. Gegebenenfalls
erfolgte eine Inaktivierung der Enzyme bei 65 bzw. 80 °C für 5 bis 10 min. Die folgende
Übersicht zeigt die detaillierte Anwendung der einzelnen Restriktionsenzyme.
Enzym
Anwendung
Tabelle 4.8: Übersicht verwendeter Restriktionsenzyme.
BlpI Restriktionskontrolle: kurze AGTR1 und ESR1 Inserts, AGTR1 3’-UTR
DraI Klonierung: TCF21 3’-UTR
Restriktionskontrolle: TCF21 3’-UTR
DraIII Linearisierung für IVT 1 : AGTR1 und ESR1 3’-UTR
EcoRI Restriktionskontrolle: AGTR1 und ESR1 3’-UTR
HindIII Klonierung: kurze AGTR1 und ESR1 Inserts
MluI Klonierung: ESR1 3’-UTR
NdeI Restriktionskontrolle: MRAS 3’-UTR
NotI Linearisierung für IVT: AGTR1 und ESR1 3’-UTR
SacI Klonierung: AGTR1 3’-UTR
Restriktionskontrolle: ESR1 und MRAS 3’-UTR
SalI Klonierung: TCF21 und MRAS 3’-UTR
SpeI Klonierung: AGTR1 und ESR1: kurze und 3’-UTR Inserts
1 in vitro Transkription
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