Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

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4 Methoden 4.4.3 Programme Des Weiteren wurden während dieser Arbeit neben den gängigen MS-Office Anwendungen folgende Programme verwendet: Tabelle 4.13: Übersicht verwendeter Programme. Funktion Programm kostenloser Download Klonierungsplanung pDRAW http://www.acaclone.com/ Auswertung Plasmid-Sequenzierung Chromas Quantifizierung von Gelbanden ImageQuant 5.2 Statistik Transfektionsexperimente 4 GraphPadPrism Auswertung qPCR-Experimente GeneAmp SDS 5700 Literaturverwaltung EndNote JabRef http://jabref.sourceforge.net/ Grafiken erstellen/bearbeiten Inkscape http://inkscape.org/ 4 ANOVA, * p≤0.05, ** p≤0.001, *** p≤0.0001 56
5 Ergebnisse 5.1 Erste methodische Analysen Ein methodisches Ziel des Dissertationsprojektes war vorerst die Etablierung eines zellulären Reportersystems zur Analyse des Einflusses von SNPs in miRNA Bindestellen auf die miRNA-vermittelte Regulation. Dazu wurden DNA-Oligonukleotide, die der miRNA Bindestelle des jeweiligen Ziel-mRNA Abschnittes entsprechen, synthetisch hergestellt und anschließend in einen Luciferase Reporter-Vektor kloniert. Durch anschließende Ko-Transfektion mit synthetisch hergestellten miRNAs und nachfolgender Messung der Reportergen- Aktivität sollte der Einfluss des SNPs auf die Interaktion zwischen Ziel-RNA und miRNA analysiert werden. Diese Vorgehensweise versprach ein einfaches und schnelles Screening einer Vielzahl verschiedener Kombinationen aus Ziel-mRNAs und miRNAs. Zum Testen des Reportersystems wurde anfangs nach bereits publizierten Daten zu einer entsprechenden Ziel-RNA-miRNA-Interaktion gesucht, für die das Vorhandensein eines SNPs innerhalb der Ziel-mRNA mit einer Dysregulation der miRNA-Regulation einhergeht. Nach umfassender Literatur-Recherche wurde sich für die AGTR1-miR-155-Interaktion entschieden, die durch den SNP rs5186 (A/C-Polymorphismus) beeinflusst wird. Die Ergebnisse zweier unabhängiger Arbeitsgruppen [145–147] hatten gezeigt, dass das Vorliegen der AGTR1 C-Variante zu einer verminderten Hemmung durch die miR-155 und damit zu einem Anstieg der AGTR1 Protein-Menge führt. In diesen Studien wurden bereits Reportergen- Experimente durchgeführt, jedoch enthielten die verwendeten Reporter-Plasmide jeweils die gesamte 3’-UTR Sequenz. Im Ergebnis vorgenannter Ausführungen erschien der AGTR1 rs5186 SNP als geeigneter Modell-SNP, um mit der Etablierung eines Zellkultur-Reportersystems zu beginnen. 57
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Aus dem Institut für Molekulare Me
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Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassun
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5 Ergebnisse 57 5.1 Erste methodisc
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6.4 Detektion von RNA-RNA-Komplexen
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1 Zusammenfassung das Modell der Be
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2 Einleitung DNA Zellkern Zytoplasm
Seite 16 und 17: 2 Einleitung Patienten Kontroll-Per
Seite 18 und 19: 2 Einleitung benötigten. Das detai
Seite 20 und 21: 2 Einleitung suppressorgene agieren
Seite 22 und 23: 2 Einleitung miR-SNP SNP in miRNA G
Seite 24 und 25: 2 Einleitung Abelson et al. [105] a
Seite 27 und 28: 3 Material 3.1 Allgemeines Im Anhan
Seite 29 und 30: 3.4 Chemikalien 3.3 Verbrauchsmater
Seite 31 und 32: 3.5 Nukleinsäuren 3.5 Nukleinsäur
Seite 33 und 34: 3.5 Nukleinsäuren miR-224 guide mi
Seite 35 und 36: 3.5 Nukleinsäuren Sequenzier-Prime
Seite 37 und 38: 3.5 Nukleinsäuren cDNA-Synthese-Pr
Seite 39 und 40: 3.8 Größenmarker 3.7 Enzyme Tabel
Seite 41 und 42: 3.11 Puffer und Lösungen RNA-Faltu
Seite 43 und 44: 4 Methoden 4.1 Molekularbiologische
Seite 45 und 46: 4.1 Molekularbiologische Methoden 3
Seite 47 und 48: 4.1 Molekularbiologische Methoden e
Seite 49 und 50: 4.1 Molekularbiologische Methoden S
Seite 51 und 52: 4.2 Nukleinsäureanalytische Method
Seite 63 und 64: 4.3 Zellbiologische Methoden 4.3.2
Seite 65: 4.4 Computergestützte Methoden und
Seite 69 und 70: 5.3 Untersuchungen im AGTR1-System
Seite 87 und 88: 5.4 Untersuchungen im ESR1-System k
Seite 89 und 90: 5.4 Untersuchungen im ESR1-System D
Seite 91 und 92: 5.4 Untersuchungen im ESR1-System I
Seite 93 und 94: 5.4 Untersuchungen im ESR1-System R
Seite 95 und 96: 5.5 Untersuchungen weiterer polymor
Seite 101 und 102: 5.6 Untersuchungen im MRAS-System D
Seite 103 und 104: 1720 5.6 Untersuchungen im MRAS-Sys
Seite 105 und 106: 5.6 Untersuchungen im MRAS-System 1
Seite 107 und 108: 5.6 Untersuchungen im MRAS-System D
Seite 109 und 110: 5.6 Untersuchungen im MRAS-System 5
Seite 111 und 112: 5.7 Untersuchungen im DHFR-System 5
Seite 113 und 114: 5.7 Untersuchungen im DHFR-System D
Seite 115 und 116: 5.8 Untersuchungen im TCF21-System
Seite 117 und 118:
5.8 Untersuchungen im TCF21-System
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6 Diskussion 6.1 Verfügbare Online
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6.1 Verfügbare Online-Tools zur An
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6.2 Einfluss SNP-induzierter RNA-St
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6.4 Detektion von RNA-RNA-Komplexen
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6.5 siRNA-vermittelte Regulation po
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6.6 Erkenntnisse für zukünftige A
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6.7 Weitere funktionelle Analysen d
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6.8 Gen-spezifische RNAi-vermittelt
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7 Literaturverzeichnis [1] CHEN, K.
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7 Literaturverzeichnis with warfari
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7 Literaturverzeichnis P. A. ; MUMM
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7 Literaturverzeichnis [99] DUAN, R
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7 Literaturverzeichnis altering str
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7 Literaturverzeichnis novel single
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A Anhang A.1 PCR-Details Im folgend
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A.1 PCR-Details Für jede der durch
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A.1 PCR-Details Tabelle A.12: Detai
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A.3 Abkürzungsverzeichnis AG Arbei
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A.4 Verzeichnis gebräuchlicher, fr
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A.5 Abbildungsverzeichnis 5.15 Loka
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A.6 Tabellenverzeichnis 3.9 Sequenz
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A.7 Publikationsliste A.7 Publikati
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