Mechanistische Analysen zu Krankheits-korrelierten SNPs in ...

5 Ergebnisse
120
100
88,6 91,7
76,4
FL/RL in %
80
60
40
20
52,7
19,2
13,4
42,3
31,2
49,1
38,2
28,4
20,4
0,1 nM
1 nM
10 nM
0
TCF21 3'-UTR C TCF21 3'-UTR G TCF21 3'-UTR C TCF21 3'-UTR G
siTCF21 C
siTCF21 G
Abbildung 5.46: Hemmung der Expression von TCF21 3’-UTR Luciferase-Reportern durch siRNAs.
HeLa-Zellen wurden im 96-well Format mit je 10 ng TCF21 3’-UTR Reporterplasmid (pmirGLO TCF21
3’-UTR C bzw. G) und steigenden Konzentrationen an siTCF21 C bzw. G ko-transfiziert. Nach 24 h
wurden die Zellen lysiert und anschließend die Luciferase-Aktivitäten gemessen. Die relativen firefly
Luciferase-Aktivitäten (FL/RL) wurden auf Ansätze ohne siRNA (nur Plasmid-DNA) normiert. Dargestellt
sind die Mittelwerte und Standardabweichungen zweier unabhängiger Experimente.
Die Ergebnisse der siRNA-vermittelten Repression der TCF21-Varianten können nur zum
Teil mit den Bindungsenergien zwischen der Ziel-RNA und dem siRNA guide Strang erklärt
werden. Die TCF21 C-siTCF21 G-Interaktion, die durch den C-C mismatch den größten
Energieverlust (siehe Abb. 5.45) aufweist, zeigt auch durchweg die geringste Hemmung im
Reporter-Assay. Trotz gleicher Bindungsenergien für die jeweils 100 % komplementären Bindungen
weisen beide TCF21-Varianten jedoch eine differenzierte Repression auf. Dies lässt
vermuten, dass auch die siRNA-vermittelte Regulation von TCF21 von strukturellen Unterschieden
der TCF21-Varianten geprägt ist.
5.8.7 RNA-Strukturprobing
Zur Durchführung des TCF21-Strukturprobings wurden zunächst in vitro Transkripte der gesamten
TCF21 3’-UTR-Sequenz sowie des zuvor beschriebenen, 200 nt langen Ausschnittes
generiert (siehe Abb. 5.47).
118